Ribonukleinsyra (RNA) biosyntes i mänsklig cancer

Rudolf Virchow (1821-1902) anses vara den förste som kände igen leukemiceller, och Fridrich Miescher (1844-1895) hade identifierat och isolerat cellulär substans som innehöll kväve och fosfor, medan Albrecht Kossel (1853-1927) isolerade nukleinsyrorna: Två puriner (adenin och guanin) och tre pyrimidiner (tymin, cytosin och uracil) . Cancer definieras dock som en grupp av mer än 100 olika sjukdomar som orsakas av flera förändringar i cellens DNA och RNA och kännetecknas av okontrollerbar tillväxt (mitos) där cellerna är aggressiva, invasiva och ibland metastatiska . Upptäckten av DNA-molekylens dubbelspiral av Watson och Crick var också en ytterligare milstolpe i 1900-talets vetenskap (figur 1). Det genetiska materialet i levande organismer och DNA-molekylens dubbelspiral utgjorde grunden för den nya disciplinen molekylärbiologi.

Figur 1

De viktiga enkelsträngade RNA- och tvåsträngade DNA-nukleinsyrorna.

En komplett vändning av DNA:s dubbelspiral sträcker sig över tio baspar som täcker ett avstånd på 34 Ǻ (3,4 nm). De enskilda basparen har ett avstånd på 34 Ǻ (3,4 nm) från varandra. På de ställen där strängarna korsar varandra döljer sig baspar som sträcker sig vinkelrätt mot betraktaren. Innerdiametern är 11 Ǻ (1,1 nm) och ytterdiametern 20 Ǻ (2,0 nm). Inom dubbelspiralens cylindriska kontur finns två spår som är tillräckligt stora för att hysa polypeptidkedjor. Den största mänskliga kromosomen, kromosom nummer 1, består av cirka 220 miljoner baspar och är 85 nm lång. Minustecknen vid sidan av dubbelhelixsträngarna representerar många negativt laddade fosfatgrupper längs hela längden på varje sträng. Till skillnad från dubbelsträngat DNA är RNA en enkelsträngad molekyl i många av sina biologiska roller och har en mycket kortare kedja av nukleotider. RNA kan dock, genom komplementär basparning, bilda dubbelhelixer inom strängen, som i tRNA. Medan DNA innehåller deoxyribose innehåller RNA ribose (i deoxyribose finns det ingen hydroxylgrupp knuten till pentosringen i 2′-positionen). Dessa hydroxylgrupper gör RNA mindre stabilt än DNA eftersom det är mer benäget för hydrolys. Den komplementära basen till adenin är inte tymin, som i DNA, utan snarare uracil, som är en icke-metylerad form av tymin.

Övertagit från: Watson J.D. and Crick, F.H.C. (1953) ”Molecular structure of nucleic acid. A structure of deoxyribosenucleic acid”, Nature, vol.171, pp.737-738; Gregory, S., Barlow, K.F., McLay, K.E., Kaul, R., Swarbreck, D., Dunham, A., Scott, C.E., Howe, K.L. och Woodfine, K. (2006). ”DNA-sekvens och biologisk annotering av mänsklig kromosom 1”. Nature, vol. 441 (7091), pp.315-221; Nelson, D.L. and Cox, M.M. (2008) Lehninger Principles of Biochemistry, 5th edn, pp.277-287. New York, NY: W.H. Freeman and Company.

Den detaljerade mekanismen genom vilken sådant genetiskt material kunde uttryckas som de strukturella och katalytiska proteiner som spelar en så viktig roll för alla levande cellers funktion var fortfarande inte uppenbar . Stanley Miller (1930-2007) och Harold Urey (1893-1981) utformade ett experiment som simulerade hypotetiska förhållanden som man trodde fanns vid tiden för det tidiga livet på jorden och testade kvalitativt förekomsten av jordiska kemikalier som gav upphov till liv . De grundläggande kemiska elementen H2, CH4, H2O och NH3, som var inneslutna i sterila glaskolvar och rör, utsattes för elektriska urladdningar och interaktionen gav upphov till 20 aminosyror, som är byggstenar för proteiner, samt andra organiska föreningar som adenosintrifosfat, lipider, vissa sockerarter och baserna för RNA och DNA (Lazcano och Bada ).

Crick et al. utformade en elegant experimentell strategi för att fastställa den genetiska kodens natur som anmärkningsvärt nog var den korrekta trots avsaknaden av teknik för att analysera och jämföra DNA- och proteinsekvenser. Den genetiska koden är förhållandet mellan basernas sekvens i DNA (eller dess RNA-transkript) och aminosyrornas sekvens i proteiner . Den genetiska koden har följande egenskaper: (1) tre nukleotider kodar för en aminosyra, (2) koden är icke överlappande, (3) koden har ingen interpunktion och (4) den genetiska koden är degenererad .

Prolin skiljer sig endast från denna grundstruktur eftersom den innehåller en ovanlig ring till N-ändans aminegrupp, vilket tvingar CO-NH-amiddelen till en fast konformation . När detta konceptuella genombrott väl hade gjorts kunde den komplexa uppgiften att reda ut de många stegen i proteinbiosyntesen börja i laboratoriet . Sekvensen av aminosyror i ett protein definieras av en gen och kodas i den genetiska koden. Även om denna genetiska kod specificerar 20 olika L-α-aminosyror, förändras resterna i ett protein ofta kemiskt genom posttranslationell modifiering: antingen innan proteinet kan fungera i cellen eller som en del av kontrollmekanismer .

Gener består av nukleinsyror som innehåller instruktionerna för att tillverka proteiner; enzymer består också av proteiner och de behövs för att replikera gener .

Geninformation som kodas i de två komplementära strängarna av DNA:t i en strukturell gen transkriberas av ett enzym som kallas DNA-beroende RNA-polymeras och som katalyserar syntesen av RNA från en DNA- eller RNA-mall . De eukaryota RNA-polymeraserna (pol-I , pol-II och pol-III) är de centrala multiproteinmaskinerna. Det DNA-beroende RNA-polymeraset gör en enkelsträngad RNA-kopia som är komplementär till en av de strängar som kallas mRNA. Denna kopplas till en subcellulär organell ribosom som består av två underenheter med en diameter på mellan 25 och 30 nm (250-300 Å) och ett förhållande mellan rRNA och rotein som är nära 1 . Den fungerar som en svart låda som används för att översätta mRNA. Termen översättning omfattar alla de steg genom vilka det genetiska innehållet i det mRNA som finns i den linjära sekvensen av ribonukleotider omvandlas till en linjär sekvens av aminosyror . Även om mRNA kan betraktas som det medel genom vilket den genetiska informationen faktiskt överförs från genomet (DNA) och placeras på lämpliga cytoplasmatiska platser för översättning till protein . Organellernas biogenes och underhåll kräver nysyntetiserade proteiner, som var och en måste gå från ribosomen som översätter sitt mRNA till den korrekta translokationen till en organell delkompartment . Intressant nog har det visats att den fett- och fetmaassocierade genen är belägen på kromosom 16 för mRNA-demetylas , dvs. metylering av mRNA spelar en kritisk roll i människans energihomeostas .

Nukleinsyrorna sätts samman av enskilda nukleotider precis som proteiner sätts samman av enskilda aminosyror. Nukleotiderna syntetiseras genom en rad enzymmedierade-medierade reaktioner . Biokemiska vägar följs separat för syntesen av ribosen och de olika baserna som sedan sätts samman till nukleotidtrifosfater . Den energibärande molekylen ATP, som består av basen adenin, ribose och tre fosfatgrupper, är också en av de nukleotidbyggstenar som används vid syntesen av RNA, och de andra är guanosintrifosfat, cytidintrifosfat och uridintrifosfat . Dessa nukleotider syntetiseras vanligtvis genom överföring av energi från ATP till deras difosfatformer av nukleotiderna . Det finns således en allmän pool av nukleotidtrifosfater som fungerar som byggstenar för RNA i cellen . Dessa fria nukleotider sätts samman till en linjär sekvens där RNA-molekylen innehåller en del av den kodade information som finns i DNA, och när DNA kopieras till mRNA med hjälp av basparning av adenin-tymin och guanin-cytosin är processen för DNA-transkription . Under syntesen av mRNA avvecklas bindningarna mellan dessa par i DNA, adenin-thymin och guanin-cytosin, och den dubbelsträngade strukturen delvis och de två strängarna separeras . Baserna i de fria nukleotidtrifosfaterna och baserna i en av de separerade DNA-kedjorna bildar nya bindningar. DNA fungerar därför som en mall för att styra sekvensen av baserna i RNA. Basen adenin i den fria nukleotiden skulle para ihop med basen tymin i DNA, och basen uracil i den fria nukleotiden skulle också para ihop med basen adenin i DNA. På samma sätt parar sig basen cytosin i den fria nukleotiden med basen guanin i DNA, och basen guanin i den fria nukleotiden parar sig med basen cytosin i DNA . Resultatet blir en ny sekvens av baser i RNA som är en enantiomer spegelbild av bassekvensen i DNA . Eftersom den främsta fördelen med basparering av nukleotider är att DNA:s två strängar kan replikera sig lätt och noggrant, kan varje bas bara para sig med en annan bas (tymin till adenin, adenin till tymin, cytosin till guanin och guanin till cytosin). Om den ursprungliga DNA-kodonen innehåller bassekvensen cytosin-guanin-thymin är den komplementära kodonsekvensen i mRNA således guanin-cytosin-adenin .

När de lämpliga fria nukleotidtrifosfaterna är baskopplade till motsvarande baser i DNA förenas nukleotiderna med varandra av enzymet RNA-polymeras II (12 underenheter) som gör att pyrofosfat avskiljs från nukleotidtrifosfat i samband med att en nukleotid kopplas till nästa, vilket bildar socker-fosfatryggen i mRNA . Detta enzym är endast aktivt i närvaro av DNA och kopplar inte ihop de fria nukleotidtrifosfaterna i dess frånvaro . Enzymet rör sig längs DNA-strängen och kopplar en nukleotid i taget till den växande mRNA-kedjan . RNA-polymeras II:s aktivitet är DNA-beroende, vilket innebär att det måste ha en DNA-mallmolekyl innan det kan syntetisera RNA-transkriptet. Det DNA-beroende polymeraset måste också ha Mg2+ och ribonukleosid 5′-trifosfater för att kunna utföra RNA-syntesen. RNA-polymeraset skapar den nya RNA-strängen från 5′ till 3′ .

Proteinuttrycket bestäms av transkriptionshastigheten och av processer efter transkriptionen som leder till förändringar i mRNA:s transport, stabilitet och översättningseffektivitet . Dessa posttranskriptionella processer förmedlas av RNA-modifieringar, sekundärstruktur, mikro-RNA (miRNA) och RNA-bindande proteiner som känner igen reglerande element som finns i de 3′ otranslaterade regionerna av transkriptioner . Den kritiska cellulära processen med polyadenylering som är tillägget av poly (A) svans till mRNA som spelar viktiga roller i många aspekter av den cellulära metabolismen av mRNA, även om den börjar när transkriptionen av en gen slutar eller avslutas. Det 3′-msta segmentet av det nytillverkade pre-MRNA klyvs först av en uppsättning proteiner. Dessa proteiner syntetiserar sedan poly(A)-svansen på någon av flera möjliga platser . Klyvningen genererar den fria 3′-hydroxylgruppen som definierar slutet av mRNA till vilket adeninrester omedelbart läggs till av polyadenylatpolymeras som katalyserar reaktionen:

$$ \mathrm{R}\mathrm{N}\mathrm{A} + \mathrm{nATP} \circ ledR\ \mathrm{R}\mathrm{N}\mathrm{A}\hbox{-} {\left(\mathrm{A}\mathrm{M}\mathrm{P}\right)}_{\mathrm{n}} + {\mathrm{n}\mathrm{P}\mathrm{P}}_{\mathrm{i}} $$

där n = 200-250 . Poly(A)-svansen och dess associerade proteiner är mer benägna att skydda mRNA från enzymatisk förstörelse . Proteinkodande gener kan ha mer än en polyadenyleringsplats, ”extra RNA”, så en gen kan koda för flera mRNA som skiljer sig åt i 3′-ändan , även om mRNA-polyadenylering styrs av olika cis-verkande element som omger klyvningsstället och deras bindningsfaktorer. Eftersom alternativ polyadenylering ändrar längden på den otranslaterade 3′-regionen är global förkortning av otranslaterade 3′-regioner genom alternativ polyadenylering ett framväxande kännetecken för cancer ; det kan också ändra vilka bindningsställen för miRNA som den otranslaterade 3′-regionen innehåller . Polyadenylering är alltså ett sätt att markera RNA för nedbrytning för många icke-kodande RNA, inklusive tRNA, rRNA, snRNA och snoRNA . RNA-exosomen (30-100 nm) är ett bevarat nedbrytningsmaskineri, som får full aktivitet endast när det är associerat med kofaktorer. Poly(A)-svansar har hittats på mänskliga RNA-fragment av både homopolymera och mestadels heteropolymera svansar . Reglerad polyadenylering av specifika mRNA är involverad i oogenes, cellcykelutveckling och synaptisk plasticitet . Många polyadenyleringstransaktörer, däribland polyadenylatpolymeras, visar sig allt oftare vara involverade i cellcykel, apoptos och cancerprognos . Gener som genomgår alternativ klyvning och polyadenylering under cancerutvecklingen hos människor kan därför vara användbara nya biomarkörer och potentiellt inriktade på förebyggande och behandling av sjukdomar.

Mikro-RNA är en endogen klass av posttranskriptionella regulatorer som reglerar så många som en tredjedel av människans gener; de är små till sin längd (21-25 nukleotidlånga fragment) och enkelsträngade . Studier tyder på att ungefär hälften av de kända mikroRNA finns i icke-proteinkodande RNA (intron och extron) eller i intron av proteinkodande gener . De kan känna igen och binda sig till ofullständiga basparande komplementära sekvenser i den 3′-ötranslaterade regionen av flera mRNA-mål, vilket blockerar översättningen av genuttrycket eller inducerar klyvning av mRNA för att styra en mängd kritiska processer genom att antingen reducera eller hämma målmRNA:s översättningseffektivitet . Nya studier har visat att miRNA uttrycks felaktigt i olika mänskliga sjukdomar, från cancer till kardiovaskulär hypertrofi . Mikro-RNA:erna är riktade mot ~60 % av alla gener, och de är rikligt förekommande för att undertrycka 100 s av målen i alla mänskliga celler; bioinformatik visar att ett 22-nukleotid enkelsträngat RNA som består av 4 olika ribonukleotider kan ha över 1013 möjliga sekvenskombinationer. Eftersom cellen vanligtvis innehåller ~1049 miRNA måste det alltså finnas ett mycket högt utvecklingsmässigt och evolutionärt selektionstryck som endast utnyttjar specifika miRNA-oligonukleotidsekvenser för att ge biologiskt användbara miRNA-mRNA-interaktioner. Biogenesen av miRNA liknar andra RNA som börjar med DNA-transkription. Ett primärt miRNA är ett oberoende transkript som bearbetas av RNA-polymeras II och binds i kärnan av ”mikroprocessorkomplexet” som består av ribonukleas III (ett Mg2+ -beroende endonukleas), Drosha och dess kofaktor Pasha (DGCR8) . Generering av mogna miRNA från prekursor-miRNA av ribonukleas III (Dicer1 /TRBP-komplexet i cytoplasman . Dicer är ett specialiserat ribonukleas som initierar RNA-interferens genom att klyva dubbelsträngat RNA till miRNA-fragment , och TRBP (det humana immunbristvirusets transaktiverande svar på dubbelsträngat RNA-bindande protein) är en integrerad komponent i ett Dicer-innehållande komplex .

Neoplasi som innefattar många sjukdomar är en abnormitet i cellulär differentiering, mognad och kontroll av tillväxt. Rupert Allan Willis (1898-1980) definierade neoplasm som ”en onormal vävnadsmassa vars tillväxt överskrider och är okoordinerad med de omgivande normala vävnadernas tillväxt och som kvarstår på samma överdrivna sätt efter det att de stimuli som framkallade förändringen har upphört”, och denna definition är den mest citerade. Det har också visat sig att flera neoplastiska och icke-neoplastiska sjukdomar innehåller cirkulerande nukleinsyror och att de i cancer främst kommer från tumören . Nivån av cirkulerande nukleinsyror, som har förknippats med tumörbörda och malign utveckling, används därför för cancerscreening, prognos och övervakning av effekten av en cancerbehandling .

Också Conrad H. Waddington (1905-1975) hade rapporterat om ett invecklat samspel mellan den cellulära miljön och genernas effekter på fenotypbestämningen; han tillskrev de molekylära signalerna till epigenetiska fenomen . De epigenetiska signaler som är ansvariga för att metastabila transkriptionstillstånd etableras, upprätthålls och vänds har ett direkt samband med hypermetylering av promotorer och tystade tumörsuppressorgener, transkriptionsfaktorer och DNA-reparationsenzymer. Eftersom cancer i slutändan är en genernas sjukdom är det fortfarande oklart hur den epigenetiska informationen överförs genom celldelningen, eftersom de komplexa epigenetiska tillstånden styrs av flera konvergerande signaler .

De biologiskt aktiva RNA:erna, inklusive mRNA, tRNA, rRNA, små nukleära RNA:er och andra icke-kodande RNA:er , innehåller självkompletterande sekvenser som gör det möjligt för delar av RNA:t att vika sig och para ihop sig med sig självt för att bilda dubbla spiraler (figur 2).

Figur 2

Den grundläggande processen för informationsöverföring i celler.

Analysen av dessa RNA har avslöjat att de är mycket strukturerade och att de inte består av långa dubbelspiraler utan snarare av samlingar av korta spiraler som packats ihop till strukturer som liknar proteiner. RNA viker sig och anpassar sig till enzymernas kemiska katalys , till exempel består den aktiva platsen i ribosomen som analyserar bildandet och frigörandet av peptidbindningar helt och hållet av RNA . rRNA är nödvändigt som en strukturell komponent i de ribosomer på vilka översättningen faktiskt äger rum, och tRNA behövs vid aktivering av aminosyror, som en adapter vid mRNA-riktad aminosyraspecifikation och för att binda de växande proteinkedjorna till ribosomerna (figur 2). Vid DNA-transkriptionen kontrolleras placeringen av nukleotidenheterna i de RNA-molekyler som tillverkas av det DNA som fungerar som mall. Det sätt på vilket denna mall dikterar en sådan sekvens inbegriper både basparningsinteraktioner och specifika interaktioner mellan proteiner och nukleinsyror . Varje RNA-kedja inleds på en specifik plats på DNA-mallen och avslutas på en annan unik typ av plats på mallen, dvs. det finns definierade transkriptionsenheter . Det är en selektiv process. Specifika signaler i DNA-mallen känns igen av transkriptionsapparaten. Initieringen styrs av promotorområden i DNA:t, och det område som styr termineringen benämns terminator .

(1) Transkription: Information kodad i DNA:s nukleotidsekvens transkriberas genom syntes av mRNA vars sekvens dikteras av DNA-sekvensen. (2) Översättning: När sekvensen av mRNA avkodas av proteinsyntesmaskineriet översätts den till sekvensen av aminosyror i ett protein. Denna informationsöverföring är inkapslad i dogmen: DNA → RNA → Protein.

Antaget från: Hernández, G. (2012) On the Emergence and Evolution of the Eukaryotic Translation Apparatus, in Cell-Free Protein Synthesis, Biyani, M. (red.), s.32. Hämtad 13 september 2014 från http://cdn.intechopen.com/pdfs-wm/39965.pdf.

Archibald Garrod (1857-1936) var en av de första vetenskapsmännen som föreslog att ärftliga faktorer (gener) styrde proteiners funktion . Brister (sjukdomar) i ämnesomsättningen kunde kopplas till att specifika enzymer inte klarar av att katalysera viktiga biokemiska reaktioner. Proteinsyntesen, translation, styrs av en mRNA-molekyl. Translation kan ses ske i två faser: (1) informationsöverföring, där mRNA:s RNA-bassekvens bestämmer sekvensen av aminosyror och (2) kemiska processer, där peptidbindningarna mellan de intilliggande aminosyrorna bildas. De komponenter som krävs för översättning är bland annat: mRNA, ribosomer (60S och 40S), tRNA, aminoacyl tRNA-syntetaser samt tillbehörsproteiner som är involverade i initiering, förlängning och avslutande . Elongationen kan anses omfatta tre processer: (1) inriktning av varje aminoacylerat tRNA, (2) bildande av peptidbindningen för att lägga till den nya aminosyran till polypeptidkedjan och (3) förflyttning av ribosomen längs mRNA:t med ytterligare tre baser (ett kodon). Elongationen fortsätter tills en stoppkodon nås. Det finns tre stoppkodoner i den genetiska koden: UAG, UGA, UAA .

Det är utomordentligt svårt att bedöma de cancerframkallande effekterna av så många jordbruks-, industri- och hushållskemikalier, men en betydande fara utgörs av bortskaffandet av olika jordbruks- och industriavfall som kan förorena dricksvatten, kustvatten och föroreningar av det marina livet . Det är också problematiskt att identifiera ett kemiskt cancerframkallande ämne på grund av den långa fördröjningen mellan kemisk exponering och utvecklingen av cancer, om inte effekten är dramatisk . Med tanke på det stora antalet kemiska ämnen som människor möter under sina liv, visar tabell 1 de mest starkt bevisade cancerframkallande kemikalierna.

Tabell 1 Viktiga kemiska cancerframkallande ämnen hos människor

Virus är en ultramikroskopisk virion som är inlindad i en skyddande beläggning av protein, infektiöst agens, obligata intracellulära parasiter vars replikation är beroende av dess kärn-DNA eller RNA och proteinsyntetiska process i värdcellen för tillväxt i vävnadskultur . De viktigaste patogena virusen är adenoviridae, flaviviridae, hepadnaviridae, herpesviridae, homyxoviridae, papovaviridae, paramyxoviridae, picornaviridae, polyomaviridae, orthomyxoviridade, rhabdoviridae och togaviridae . Virusinfektionen når vanligen optimal tid som funktion av replikation när kliniska symtom uppträder , och replikationen består av följande steg: (1) fastsättning i och penetration av mottaglig cell, (2) demontering av icke-strukturella proteiner för att göra nukleinsyra tillgänglig för virusförökning, (3) syntes av RNA eller DNA genom transkription och översättning (figur 2), (4) syntes av strukturella och funktionella proteiner, och (5) sammansättning och frisättning av mogna viruspartiklar från cellen . Tabell 2 visar antivirala kemiska medel som kliniskt skulle kunna blockera virusreplikation när de administreras i samband med insjuknande, dvs. kemoprofylax.

Tabell 2 Antivirala medel och några av deras egenskaper

Metodik

Vid infektion genomtränger ett viralt RNA mänskliga värdcellsmembran, varpå det antingen förstörs av flera cellulära RNaser , eller så binder det sig till ribosomer och växer och delar sig för att tillverka proteiner i en oreglerad snabbare takt . Transkriptionscykelprocessen som består av: preinitiering, initiering, promotorrensning, förlängning och avslutande har en betydande inverkan på tumörers tillväxtpotential . Värdcellens misslyckande med att känna igen och förstöra virusinfektionen orsakas av bristen på särskilda samstimulerade molekyler som bidrar till hur antigener reagerar med lymfocyter . Grundforskningen om cancer omfattar därför identifiering av orsaker och utveckling av strategier för förebyggande, diagnostisering, behandling och botande . Forskningen omfattar kemoterapi, hormonterapi, immunterapi, nanomaterial, palliativ kirurgi, strålbehandling och kombinerade behandlingsmetoder: (1) cytologiska metoder (exfoliativ och aspirationscytologi), (2) flödescytometri, (3) hystologiska metoder, (4) immunohistokemi, (5) molekylär diagnostik (aptamerer), (6) tumörmarkörer (hormoner (kalcitonin, katekolamin & metaboliter, ektopiskt, humant kroniskt gonadotropin-HCG), onkofetala antigener (α-fetalprotein, carcino embryonalt antigen), isoenzymer, specifika proteiner, muciner och glykoproteiner, nya molekylära markörer).

RNA-fager av varje steg i proteinsyntesen som skulle kunna vara möjligt att kontrollera, är ett tecken på individuell interrelaterad biosyntes av ett visst protein . Hastigheten för initieringskomplexbildningen dikterar mängden av vart och ett av de virala proteinerna . RNA-polymeraserna börjar replikera det virala RNA:t, en process som är en av de mest centrala mediatorerna för malign omvandling . RNA-polymeras I , RNA-polymeras II och RNA-polymeras III transkriberar proteinkodande gener och de interagerar med faktorer som är involverade i syntesen av prekursor rRNA 45S, kromatinremodellering, transkriptionsaktivering, förlängning och RNA-bearbetning.

De flercelliga eukaryota humana enzymerna kan renas med hjälp av isolerade organeller som kärnor, nukleoler, mitokondrier och andra inre organeller som utgångsmaterial, även om samtidig återvinning av alla tre RNA-polymeraserna inte alltid är möjlig på grund av den diffusa karaktären hos en del av kärnenzymerna . Jacob och Rose hade utförligt granskat metoderna för lösliggörande, rening och svårigheter för däggdjurs RNA-polymeraser.

HeLa-celler var ofta källan för RNA-polymeraskomplex; mitotiska celler och cancervävnader med motsvarande normala vävnader som kan samlas in och frysas ner i flytande kväve vid -80°C, bevaras på ett livskraftigt sätt tills de är testade . Histopatologisk undersökning görs på de 10 % formalinfixerade, paraffininbäddade vävnadsproverna, vilket är en ovärderlig resurs för klinisk forskning, även om de extraherade nukleinsyrorna är fragmenterade och kemiskt modifierade, vilket gör dem svåra att använda i molekylära studier . Histopatologiska observationer används vid progression, känslighet för metastaser, känslighet för terapi och strålbehandling samt prognos. Intressant är att den icke-invasiva tekniken Ramanspektroskopi gör det möjligt att observera intracellulära biologiska molekyler utan fixering eller märkning in situ .

Bicinchoninsyrakitets proteinkvantifieringsanalys som används allmänt för att bestämma proteinkoncentrationer i området 25-2000 μg/ml. Cellerna suspenderas och lyseras i hypotonisk buffert (20 mM Tris-HCl , 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM ZnCl2 innehållande 1 % Triton X-100) i 5 minuter på is; de separerades sedan i nukleolära och nukleoplasmatiska fraktioner genom zoncentrifugering i sackaros vid 15 000 rpm i 15 minuter vid 4 °C, och supernatanten samlades upp och frystes vid -20 °C tills den återanvänds. Denna metod är en modifierad form av Lowry et al. och Bradford-metoden, som också är allmänt använda färgämnesbindande kromogena proteinvariationsanalyser . Bradford-proteinanalysen bygger på att specifika aminosyrarester, arginin, lysin och histidin, förenas med icke-konjugerade grupper av Coomassie briljantblått G-250-färgämne i en sur miljö. När färgämnesproteinkomplexet bildas omvandlas den rödbruna sura lösningens pKa till blått och mäts vid 595 nm. Bradford-färgämnet är bekvämt att använda, snabbt och relativt känsligt, men flera föreningar kan störa analysen mot typiska standardkurvor för bovint serumalbumin och bovint gammaglobulin. Den andra proteinanalysen från Lowry et al. bygger på bildandet av peptidkvävekomplex med Cu2+ under alkaliska förhållanden (pH 10,0-10,5) och den efterföljande reduktionen av Folin-Ciocalteay-fosfomolybdiska fosfotungsyra-reagenset till heteropolymolybdenblått vid spektrum 750 nm, även om etylendiamintetraättiksyra (EDTA) kan störa produktionen av kromoforer .

Radioimmunohistokemi är en mycket känslig in vitro-teknik där en spårbar radioaktiv isotop markerar en markör för att detektera, identifiera och kvantifiera koncentrationen av specifika ämnen för kemisk neoplasi . Radioimmunoassay har utvecklats för att identifiera och kvantifiera koncentrationen av RNA-polymeras I , RNA-polymeras II , RNA-polymeras III och mRNA . Även om det är mindre känsligt än enzymisk aktivitet som ett mått på omvänt transkriptas, men det kan detektera antigen med hjälp av små mängder protein och i närvaro av hämmare för en RNA-tumörvirusproducerande celler .

De tre RNA-polymeraserna transkriberar arvsmassan i cellkärnorna. RNA-polymeras II som ansvarar för syntesen av mRNA och ett stort antal icke-kodande RNA, är mest viktigt; RNA-produktionen i växande celler utförs av RNA-polymeras I som transkriberar prekursorn till stort rRNA och av RNA-polymeras III som transkriberar rRNA, tRNA och vissa icke-kodande RNA . Hossenlopp et al. har använt serum mot polymeras I för att klassificera de tre RNA-polymeraserna i den ordning de hämmas: I > III > I, vilket tyder på att polymeraserna I och II är närmare besläktade än polymeraserna I och II .

Fynd och tolkningar

Den differentiella effekten av selektiv hämning på nukleär och nukleoplasmatisk RNA-sysnosnthes är relaterad till existensen av distinkta nukleära och kromosomala RNA-polymeraser som orsakar mitotiska-liknande biokemiska och morfologiska svar. Dessutom visas att ribosomsyntesen i HeLa-celler kontrolleras på bearbetningsnivå snarare än på nivån för 45S RNA-transkription, där kemiska medel skulle orsaka de fysiologiska och strukturella övergångarna av viral mitos . I tabell 2 förtecknas några av dessa terapeutiska medel som kan anses störa processen för virusreplikation.

Slutningsvis har tillkomsten av sekvensering av det mänskliga genomet underlättat de imponerande framstegen inom diagnos, prognos och behandlingsmetoder för invasiva mänskliga tumörceller. Ett nytt forskningsområde är kemiska medel som stör mitosrelaterad celldöd (apoptos), kan denaturera kemoterapiresistenta neoplastiska celler och hämma proteinuttryck. Giri och Kumar har rapporterat att överuttryck av neo-poly(A)-polymeras i mänskliga cancerceller visar på polyadenyleringens betydelse för cancerceller. Specificiteten hos en elektrostatisk interaktion mellan RNA och naturliga alkaloider eller deras syntetiska analoger har visat sig kunna framkalla en självstruktur i polyadeneleringen. Nya, nya föreningar som uppvisar utmärkt bindningsaffinitet till många RNA-strukturer kan därför användas för att modulera poly(A)-strukturen vid utveckling av RNA-riktade cancerterapier. Nanopartiklar av aptamerer är också på väg att växa fram för att rikta reaktionen av specifika antigenepitoper mot deras bindningsställen. Detta är lovande tekniker för klinisk diagnostik och terapi. Sådana nya insikter i tumörernas genetik har lett till banbrytande insikter i utvecklingen av nya läkemedel som kan behandla, krympa och få tumörer att gå i långvarig remission.

Lämna en kommentar