Biosinteza acidului ribonucleic (ARN) în cancerul uman

Rudolf Virchow (1821-1902) este în general creditat ca fiind primul care a recunoscut celulele leucemice, iar Fridrich Miescher (1844-1895) a identificat și izolat substanța celulară care conține azot și fosfor, în timp ce Albrecht Kossel (1853-1927) a izolat acizii nucleici: două purine (adenină și guanină) și trei pirimidine (timină, citosină și uracil) . Cu toate acestea, cancerul este definit ca un grup de peste 100 de boli diferite care este cauzat de modificări multiple ale ADN-ului și ARN-ului celular și se caracterizează printr-o creștere necontrolată (mitoză) în care celulele sunt agresive, invazive și uneori metastatice . De asemenea, descoperirea dublei helixuri a moleculei de ADN de către Watson și Crick a reprezentat o piatră de hotar suplimentară în știința secolului XX (Figura 1). Materialul genetic al organismelor vii și dubla elice a moleculei de ADN au constituit fundamentul noii discipline a biologiei moleculare.

Figura 1

Acizii nucleici esențiali ARN monocatenar și ADN bicatenar.

O spire completă a dublei helixuri de ADN se întinde pe zece perechi de baze care acoperă o distanță de 34 Ǻ (3,4 nm). Perechile de baze individuale sunt distanțate la o distanță de 34 Ǻ (3,4 nm). Locurile în care firele se încrucișează ascund perechi de baze care se întind perpendicular pe privitor. Diametrul interior este de 11 Ǻ (1,1 nm), iar diametrul exterior de 20 Ǻ (2,0 nm). În interiorul conturului cilindric al dublei elice se află două caneluri care sunt suficient de mari pentru a găzdui lanțuri polipeptidice. Cel mai mare cromozom uman, cromozomul numărul 1, este format din aproximativ 220 de milioane de perechi de baze și are o lungime de 85 nm. Semnele minus de lângă șirurile dublei elice reprezintă numeroasele grupe fosfat încărcate negativ de-a lungul întregii lungimi a fiecărui șir. Spre deosebire de ADN-ul bicatenar, ARN-ul este o moleculă monocatenară în multe dintre rolurile sale biologice și are un lanț de nucleotide mult mai scurt. Cu toate acestea, ARN-ul poate, prin împerechere complementară de baze, să formeze duble helixuri în interiorul catenei, ca în cazul ARNt. În timp ce ADN-ul conține dezoxiriboză, ARN-ul conține riboză (în cazul dezoxiribozei nu există nicio grupare hidroxil atașată la inelul pentoză în poziția 2′). Aceste grupări hidroxil fac ca ARN-ul să fie mai puțin stabil decât ADN-ul, deoarece este mai predispus la hidroliză. Baza complementară adeninei nu este timina, așa cum este în ADN, ci uracilul, care este o formă nemetilată a timinei.

Adoptat din: Watson J.D. și Crick, F.H.C. (1953) „Molecular structure of nucleic acid. A structure of deoxyribosenucleic acid”, Nature, vol.171, pp.737-738; Gregory, S., Barlow, K.F., McLay, K.E., Kaul, R., Swarbreck, D., Dunham, A., Scott, C.E., Howe, K.L. și Woodfine, K. (2006). „The DNA sequence and biological annotation of human chromosome 1” (Secvența ADN și adnotarea biologică a cromozomului 1 uman). Nature, vol. 441 (7091), pp.315-221; Nelson, D.L. și Cox, M.M. (2008) Lehninger Principles of Biochemistry, 5th edn, pp.277-287. New York, NY: W.H. Freeman and Company.

Mecanismul detaliat prin care un astfel de material genetic ar putea fi exprimat ca proteine structurale și catalitice care joacă un rol atât de important în funcționarea tuturor celulelor vii nu era încă evident . Stanley miller (1930-2007) și Harold Urey (1893-1981) au conceput un experiment care a simulat condiții ipotetice despre care se credea că ar fi fost prezente în momentul apariției vieții timpurii pe Pământ și au testat calitativ apariția substanțelor chimice terestre care au dat naștere vieții . Elementele chimice esențiale H2, CH4, H2O și NH3, care au fost limitate la flacoane și tuburi de sticlă sterilă, au fost supuse unor descărcări electrice, iar interacțiunea a produs 20 de aminoacizi, componenta de bază a proteinelor, precum și alți compuși organici precum: adenozin trifosfat, lipide, unele zaharuri și bazele pentru ARN și ADN (Lazcano și Bada ).

Crick et al. au conceput o strategie experimentală elegantă pentru a determina natura codului genetic care a fost în mod remarcabil cea corectă, în ciuda absenței tehnologiei de analiză și comparare a secvenței ADN și a secvenței proteice. Codul genetic este relația dintre secvența bazelor din ADN (sau din transcriptele sale de ARN) și secvența aminoacizilor din proteine . Caracteristicile codului genetic sunt următoarele: (1) trei nucleotide codifică un aminoacid, (2) codul nu se suprapune, (3) codul nu are punctuație și (4) codul genetic este degenerat .

Prolina diferă doar de această structură de bază deoarece conține un inel neobișnuit la grupul amină de la capătul N, care forțează fracțiunea amidă CO-NH într-o conformație fixă . Odată realizată această descoperire conceptuală, sarcina complexă de a desluși numeroasele etape ale biosintezei proteinelor a putut începe în laborator . Secvența de aminoacizi dintr-o proteină este definită de o genă și codificată în codul genetic. Deși acest cod genetic specifică 20 de L-α-aminoacizi L-α diferiți, reziduurile dintr-o proteină sunt deseori alterate chimic în modificări post-translaționale: fie înainte ca proteina să poată funcționa în celulă, fie ca parte a mecanismelor de control .

Genele sunt alcătuite din acizi nucleici care conțin instrucțiunile de fabricare a proteinelor; enzimele sunt, de asemenea, alcătuite din proteine și sunt necesare pentru a replica genele .

Informația genetică codificată în cele două șiruri complementare ale ADN-ului oricărei gene structurale este transcrisă de o enzimă numită ARN-polimerază ADN-dependentă care catalizează sinteza ARN-ului dintr-un șablon de ADN sau ARN . ARN-polimerazele eucariote (pol-I , pol-II și pol-III) sunt mașinării centrale multiproteice. ARN polimeraza ARN dependentă de ADN realizează o copie ARN monocatenară, complementară unuia dintre șirurile care se numesc ARNm. Aceasta se atașează la un ribozom din organela subcelulară, care este compus din două subunități cu diametrul cuprins între 25 și 30 nm (250-300 Å), cu un raport ARNr/robozom care este apropiat de 1 . Acesta funcționează ca o cutie neagră pe care este tradus ARNm. Termenul de traducere cuprinde toate etapele prin care conținutul genetic al ARNm cuprins în secvența liniară de ribonucleotide este transformat într-o secvență liniară de aminoacizi . În timp ce ARNm poate fi considerat mijlocul prin care informația genetică este de fapt transmisă de la genom (ADN) și plasată în situsurile citoplasmatice adecvate pentru a fi tradusă în proteine . Biogeneza și întreținerea organitelor necesită proteine nou sintetizate, fiecare dintre acestea trebuind să treacă de la ribozomul care îi traduce ARNm la translocarea corectă într-un subcompartiment al organitei . În mod interesant, s-a demonstrat că gena asociată grăsimii și obezității este localizată pe cromozomul 16 al ARNm demetilazei ARNm , adică metilarea ARNm joacă un rol critic în homeostazia energetică umană .

Acizii nucleici sunt asamblați din nucleotide individuale la fel cum proteinele sunt asamblate din aminoacizi individuali. Nucleotidele sunt sintetizate printr-o serie de reacții mediate de enzime . Căile biochimice sunt urmărite separat pentru sinteza ribozei și a diferitelor baze care sunt apoi asamblate pentru a forma trifosfați nucleotidici . Molecula purtătoare de energie ATP, care constă din baza adenină, riboză și trei grupe fosfat, este, de asemenea, unul dintre elementele constitutive ale nucleotidelor utilizate în sinteza ARN-ului, celelalte fiind trifosfatul de guanozină, trifosfatul de ctidin și trifosfatul de uridină . Aceste nucleotide sunt de obicei sintetizate prin transferul de energie de la ATP la formele lor difosfatate de nucleotide . Astfel, există o rezervă generală de trifosfați nucleotidici care funcționează ca blocuri de construcție pentru ARN în interiorul celulei . Aceste nucleotide libere asamblate într-o secvență liniară în care molecula de ARN conține o parte din informația codificată care este prezentă în ADN, iar atunci când ADN-ul este copiat în ARNm folosind împerecherea bazelor adenină-timină și guanină-citosină este procesul de transcriere a ADN-ului . În timpul sintezei ARNm, legăturile dintre aceste perechi din ADN, adenină-timină și guanină-citosină, și structura bicatenară se desface parțial și cele două șiruri se separă . Bazele trifosfaților nucleotidici liberi și bazele din unul dintre lanțurile de ADN separate formează noi legături. Prin urmare, ADN-ul acționează ca un șablon pentru a comanda secvența de baze din ARN. Baza adenină din nucleotidul liber se va împerechea cu baza timină din ADN, iar baza uracil din nucleotidul liber se va împerechea, de asemenea, cu baza adenină din ADN. În mod similar, baza citozină din nucleotidul liber se împerechează cu baza guanină din ADN, iar baza guanină din nucleotidul liber se împerechează cu baza citosină din ADN . Rezultatul ar fi o nouă secvență de baze în ARN, care este o imagine în oglindă enantiomerică a secvenței de baze din ADN . Deoarece avantajul principal al împerecherii bazelor nucleotidelor este că cele două șiruri de ADN se pot replica ușor și precis, fiecare bază se poate împerechea doar cu o singură altă bază (timina cu adenina, adenina cu timina, citozina cu guanina și guanina cu citozina). Astfel, dacă codonul ADN original conține secvența de baze citozină-guanină-timină, secvența complementară a codonului în ARNm este guanină-citozină-adenină .

După ce trifosfații nucleotidici liberi corespunzători sunt împerecheați cu bazele corespunzătoare din ADN, nucleotidele sunt unite între ele de către enzima ARN-polimeraza II (12 subunități) care face ca pirofosfatul să fie desprins din trifosfatul nucleotidic în procesul de legare a unui nucleotid la următorul, formând coloana vertebrală zahăr-fosfat a ARNm . Această enzimă este activă numai în prezența ADN-ului și nu leagă între ele trifosfații nucleotidici liberi în absența acestuia . Enzima se deplasează de-a lungul șirului de ADN, legând pe rând câte o nucleotidă în lanțul ARNm în creștere . Activitatea ARN-polimerazei II este dependentă de ADN, ceea ce înseamnă că trebuie să aibă o moleculă șablon de ADN înainte de a putea sintetiza transcriptul de ARN. Polimeraza dependentă de ADN trebuie să aibă, de asemenea, Mg2+ și ribonucleozide 5′ trifosfați pentru a realiza sinteza ARN. ARN polimeraza ARN creează noul șir de ARN de la 5′ la 3′ .

Expresia proteică este determinată de rata de transcriere și de procesele post-transcriere care duc la modificări în transportul ARNm, stabilitatea și eficiența traducerii . Aceste procese post-transcripționale sunt mediate de modificările ARN-ului, de structura secundară, de micro ARN-uri (miARN-uri) și de proteinele de legare a ARN-ului care recunosc elementele de reglementare situate în regiunile netranscrise 3′ ale transcriptelor . Procesul celular critic de poliadenilare care este adăugarea cozii poli (A) la ARNm care joacă roluri importante în multe aspecte ale metabolismului celular al ARNm, deși începe în momentul în care transcrierea unei gene se termină sau se termină. Segmentul 3′ cel mai îndepărtat al pre-ARNm nou creat este mai întâi scindat de un set de proteine; aceste proteine sintetizează apoi coada poli (A) în oricare din mai multe locuri posibile . Clivarea generează gruparea 3′-hidroxil liberă care definește capătul ARNm la care se adaugă imediat reziduuri de adenină de către poliadenilat polimeraza care catalizează reacția:

$$ \mathrm{R}\mathrm{N}\mathrm{A} + \mathrm{nATP} \circ ledR\ \mathrm{R}\mathrm{N}\mathrm{A}\hbox{-} {\left(\mathrm{A}\mathrm{M}\mathrm{P}\right)}_{\mathrm{n}} + {\mathrm{n}\mathrm{P}\mathrm{P}}_{\mathrm{i}} $$

unde n = 200-250 . Coada poli (A) și proteinele asociate acesteia sunt mai susceptibile de a ptotecta ARNm de distrugerea enzimatică . Genele care codifică proteine pot avea mai mult de un situs de poliadenilare, „ARN suplimentar”, astfel încât o genă poate codifica pentru mai multe ARNm care diferă prin capătul lor 3′ , deși poliadenilarea ARNm este controlată de diferite elemente cis care acționează în jurul situsului de clivaj și de factorii lor de legare. Deoarece poliadenilarea alternativă modifică lungimea regiunii 3′ netranslatate, scurtarea globală a regiunilor 3′ netranslatate prin poliadenilare alternativă este o caracteristică emergentă a cancerului ; aceasta poate schimba, de asemenea, ce situsuri de legare pentru miARN-uri conține regiunea 3′ netranslatată . Așadar, poliadenilarea este o modalitate de marcare a ARN-ului pentru degradare pentru multe ARN-uri necodificatoare, inclusiv ARNt, ARNr, ARNsn și ARNsno. Exosomul ARN (30-100 nm) este o mașinărie de degradare conservată, care obține o activitate deplină numai atunci când este asociată cu cofactori; pe fragmentele de ARN uman au fost găsite cozi poli (A) atât cozi homopolimerice, cât și cozi mai ales heterpolimerice . Poliadenilarea reglată a ARNm-urilor specifice este implicată în oogeneză, în progresia ciclului celular și în plasticitatea sinaptică . Se constată din ce în ce mai des că mulți factori de trans-acțiune a poliadenilării, inclusiv poliadenilat polimeraza, sunt implicați în ciclul celular, apoptoza și prognosticul cancerului . Astfel, genele care suferă clivaj alternativ și poliadenilare în timpul progresiei cancerului uman pot fi noi biomarkeri utili și potențial țintiți pentru prevenirea și tratamentul bolii .

Micro ARN-urile sunt o clasă endogenă de regulatori post-transcripționali care reglează până la o treime din genele umane; sunt de lungime mică (fragmente de 21-25 nucleotide-lungime) și monocatenare . Studiile sugerează că aproximativ jumătate din microARN-urile cunoscute se află în ARN-uri care nu sunt codificatoare de proteine (intron și extron) sau în intronul genelor codificatoare de proteine . Aceștia pot recunoaște și se pot lega de secvențe complementare imperfecte de împerechere a bazelor din regiunea 3′ netranslatată a mai multor ARNm țintă, blocând traducerea expresiei genei sau inducând scindarea ARNm pentru a controla o multitudine de procese critice fie prin reducerea, fie prin inhibarea eficienței traducerii ARNm țintă . Studii recente au arătat că miARN-urile sunt exprimate în mod aberant în diverse boli umane, de la cancer la hipertrofia cardiovasculară . Micro ARN-urile vizează ~ 60 % din toate genele și sunt prezente din abundență pentru a reprima 100 s de ținte în toate celulele umane; bioinformatica indică faptul că un ARN monocatenar de 22 de nucleotide compus din 4 ribonucleotide diferite, acestea pot avea peste 1013 combinații posibile de secvențe. Așadar, din moment ce celula conține de obicei ~1049 miARN-uri, trebuie să existe o presiune de selecție foarte mare de dezvoltare și evolutivă care utilizează numai secvențe oligonucleotide specifice de miARN-uri pentru a produce interacțiuni miARN-mARN-uri utile din punct de vedere biologic . Biogeneza miARN-ului este similară cu cea a altor ARN-uri, pornind de la transcrierea ADN-ului. Un miARN primar este un transcript independent procesat de ARN polimeraza II și este legat în nucleu de complexul „microprocesor” care constă din ribonucleaza III (o endonuclează dependentă de Mg2+), Drosha și cofactorul său, Pasha (DGCR8) . Generarea miARN-urilor mature din miARN-urile precursoare de către complexul ribonucleazei III (Dicer1 /TRBP din citoplasmă) . Dicer este o ribonuclează specializată care inițiază interferența ARN prin scindarea ARN-ului dublu catenar în fragmente de miARN , iar TRBP (răspunsul transactivator al virusului imunodeficienței umane la proteina de legare a ARN-ului dublu catenar) este o componentă integrală a unui complex care conține Dicer .

Neoplazia care include multe boli este o anomalie a diferențierii celulare, a maturizării și a controlului creșterii . Rupert Allan Willis (1898-1980) a definit neoplazia ca fiind „o masă anormală de țesut, a cărei creștere depășește și este necoordonată cu cea a țesuturilor normale din jur și care persistă în același mod excesiv după încetarea stimulilor care au evocat schimbarea”, iar această definiție este cea citată pe scară largă . De asemenea, s-a demonstrat că mai multe boli neoplazice și neoplazice conțin acizi nucleici circulanți și că, în cazul cancerului, aceștia provin în principal din tumoare . Prin urmare, nivelul de acizi nucleici circulanți care au fost asociați cu încărcătura tumorală și progresia malignă, sunt utilizați pentru depistarea cancerului, prognostic și monitorizarea eficacității unei terapii anticancerigene .

De asemenea, Conrad H. Waddington (1905-1975) a raportat o interacțiune complexă între mediul celular și efectele genelor asupra determinării fenotipului; el a atribuit semnalele moleculare fenomenului epigenetic . Semnalele epigenetice care sunt responsabile pentru stabilirea, menținerea și inversarea stărilor transcripționale metastabile, au o corelație directă cu hipermetilarea promotorului și cu genele supresoare de tumori reduse la tăcere, cu factorii de transcripție din amonte și cu enzimele de reparare a ADN-ului . Deoarece cancerul este în cele din urmă o boală a genelor, mecanismul prin care informațiile epigenetice sunt transmise prin diviziunea celulară rămâne neclar, deoarece stările epigenetice complexe sunt orchestrate de mai multe semnale convergente .

ARN-urile active din punct de vedere biologic, inclusiv ARNm, ARNt, ARNr, ARN nucleici mici și alte ARN-uri necodificatoare , conțin secvențe autocomplementare care permit părților ARN-ului să se plieze și să se împerecheze cu el însuși pentru a forma duble elice (figura 2).

Figura 2

Procesul fundamental al transferului de informații în celule.

Analiza acestor ARN-uri a scos la iveală faptul că sunt foarte bine structurate și că nu sunt formate din elice duble lungi, ci mai degrabă din colecții de elice scurte împachetate împreună în structuri asemănătoare proteinelor. ARN-urile se pliază și se conformează catalizei chimice a enzimelor , de exemplu, situsul activ al ribozomului care analizează formarea și eliberarea legăturilor peptidice este format în întregime din ARN . ARNr este necesar ca o componentă structurală a ribozomilor pe care are loc efectiv traducerea, iar ARNt este necesar în activarea aminoacizilor, ca adaptor în specificarea aminoacizilor dirijată de ARNm și în legarea lanțurilor proteice în creștere la ribozomi (figura 2). În procesul de transcripție a ADN-ului, poziționarea unităților de nucleotide în moleculele de ARN în curs de formare se află sub controlul ADN-ului care acționează ca șablon . Mijloacele prin care acest șablon dictează o astfel de secvență implică atât interacțiuni de împerechere a bazelor, cât și interacțiuni specifice între proteine și acizi nucleici . Fiecare lanț de ARN este inițiat într-un anumit loc de pe șablonul ADN și se termină într-un alt tip unic de loc de pe șablon, adică există unități definite de transcripție . Este un proces selectiv. Semnalele specifice din șablonul ADN sunt recunoscute de aparatul de transcriere. Inițierea este guvernată de regiunile promotoare din ADN, iar regiunea care guvernează terminarea este numită terminator.

(1) Transcripția: Informația codificată în secvența nucleotidică a ADN-ului este transcrisă prin sinteza ARNm a cărui secvență este dictată de secvența ADN-ului. (2) Traducerea: Pe măsură ce secvența de ARNm este decodificată de mașinăria de sinteză a proteinelor, aceasta este tradusă în secvența de aminoacizi dintr-o proteină. Acest transfer de informații este încapsulat în dogmă: ADN → ARN → proteină.

Adoptat din: Hernández, G. (2012) On the Emergence and Evolution of the Eukaryotic Translation Apparatus, în Cell-Free Protein Synthesis, Biyani, M. (ed.), p.32. Retrieved September13, 2014 from http://cdn.intechopen.com/pdfs-wm/39965.pdf.

Archibald Garrod (1857-1936) a fost unul dintre primii oameni de știință care a propus că factorii moșteniți (genele) controlează funcția proteinelor . Defectele (bolile) în metabolism ar putea fi legate de incapacitatea unor enzime specifice de a cataliza reacții biochimice esențiale. Sinteza proteinelor, traducerea, este dirijată de o moleculă de ARNm. Se poate observa că traducerea are loc în două faze: (1) transferul de informații, în care secvența de baze ARN din ARNm determină secvența de aminoacizi și (2) procese chimice, în care se formează legăturile peptidice între aminoacizii adiacenți. Componentele necesare pentru traducere includ: ARNm, ribozomi (60S și 40S), ARNt, aminoacil ARNt sintetaze și proteine accesorii implicate în inițiere, elongație și terminare . Se poate considera că alungirea implică trei procese: (1) alinierea fiecărui ARNt aminoacidat, (2) formarea legăturii peptidice pentru a adăuga noul aminoacid la lanțul polipeptidic și (3) deplasarea ribozomului de-a lungul ARNm cu încă trei baze (un codon). Alungirea continuă până când se ajunge la un codon de oprire. Există trei codoni de oprire în codul genetic: UAG, UGA, UGA, UAA .

Este excepțional de dificil de evaluat efectele cancerigene ale atâtor substanțe chimice agricole, industriale și de uz casnic, dar un pericol semnificativ este reprezentat de eliminarea diferitelor deșeuri agricole și industriale care pot contamina apa potabilă, apele de coastă și poluarea vieții marine . De asemenea, identificarea unui carcinogen chimic este problematică din cauza decalajului lung dintre expunerea chimică și apariția cancerului, cu excepția cazului în care efectul este dramatic . Având în vedere numărul mare de substanțe chimice pe care oamenii le-au întâlnit pe parcursul vieții lor, tabelul 1 prezintă substanțele chimice cancerigene cel mai puternic evidențiate.

Tabelul 1 Principalii agenți chimici cancerigeni la om

Virusul este un virion ultramicroscopic învelit într-un înveliș protector de proteine, agent infecțios, paraziți intracelulari obligatorii a căror replicare depinde de ADN sau ARN de bază și de procesul de sinteză a proteinelor din celula gazdă pentru a se dezvolta în cultura de țesuturi . Principalii viruși patogeni sunt adenoviridae, flaviviridae, hepadnaviridae, herpesviridae, homyxoviridae, papovaviridae, paramyxoviridae, picornaviridae, polyomaviridae, orthomyxoviridade, rhabdoviridae și togaviridae . Infecția virală atinge în mod obișnuit momentul optim în funcție de replicare odată cu apariția simptomelor clinice , iar replicarea constă în următoarele etape: (1) atașarea și penetrarea celulei susceptibile, (2) dezasamblarea proteinelor nestructurale pentru a face acidul nucleic disponibil pentru multiplicarea virusului, (3) sinteza de ARN sau ADN prin transcriere și traducere (figura 2), (4) sinteza proteinelor structurale și funcționale și (5) asamblarea și eliberarea particulelor virale mature din celulă . Tabelul 2 prezintă agenții chimici antivirali care, din punct de vedere clinic, ar bloca replicarea virusului atunci când sunt administrați pe fondul bolii, și anume chimioprofilaxia.

Tabelul 2 Agenți antivirali și unele dintre proprietățile lor

Metodologie

La infecție, un ARN viral pătrunde în membranele celulelor gazdă umane, după care fie este distrus de mai multe RNaze celulare , fie se leagă de ribozomi și crește și se divide pentru a produce proteine într-un ritm accelerat nereglementat . Procesul ciclului de transcripție, care constă în: preinițiere, inițiere, eliberarea promotorului, alungire și terminare, are un impact semnificativ asupra potențialului de creștere a tumorilor. Eșecul celulei gazdă de a recunoaște și de a distruge infecția virală este cauzat de lipsa anumitor molecule co-stimulate care ajută la modul în care antigenele reacționează cu limfocitele . Prin urmare, cercetarea fundamentală în domeniul cancerului presupune identificarea cauzelor și dezvoltarea de strategii de prevenire, diagnosticare, tratamente și vindecare . Cercetarea se întinde pe chimioterapie, hormonoterapie, imunoterapie, nanomateriale, chirurgie paliativă, radioterapie și modalități combinate de tratament ; iar metodele de evaluare au fost în principal: (1) metode citologice (citologie exfoliativă și aspirativă), (2) citometrie în flux, (3) metode histologice, (4) imunohistochimie, (5) diagnostic molecular (aptameri), (6) markeri tumorali (hormoni (calcitonină, metaboliți ai catecolaminelor &, ectopice, gonadotropina cronică umană-HCG), antigene oncofetale (proteina α-fetală, antigenul embrionar carcino), izoenzime, proteine specifice, mucine și glicoproteine, noi markeri moleculari).

ARN fagic al fiecărei etape a sintezei proteice care ar putea fi posibil de controlat, este indicativ pentru biosinteza individuală interrelaționată a unei anumite proteine . Rata de formare a complexului de inițiere dictează cantitatea fiecăreia dintre proteinele virale . ARN-polimerazele încep să reproducă ARN-ul viral, un proces dintre cei mai centrali mediatori ai transformării maligne . ARN polimeraza I , ARN polimeraza II și ARN polimeraza III transcriu genele codificatoare de proteine și interacționează cu factorii implicați în sinteza precursorului ARNr 45S, remodelarea cromatinei, activarea transcripțională, elongația și procesarea ARN-ului.

Enzimele umane eucariote multicelulare pot fi purificate folosind organite izolate, cum ar fi nucleul, nucleolii, mitocondriile și alte organite interne ca material de plecare, deși recuperarea simultană a tuturor celor trei ARN polimeraze nu este întotdeauna fezabilă din cauza naturii difuzibile a unora dintre enzimele nucleare . Jacob și Rose au trecut în revistă pe larg metodele de solubilizare, purificare și dificultăți ale ARN-polimerazelor mamiferelor.

Celele HeLa au fost adesea sursa pentru complexele ARN-polimerazelor ; celulele mitotice și țesuturile canceroase cu țesuturile normale corespunzătoare care pot fi colectate și congelate în azot lichid la -80°C, sunt conservate în mod viabil până la eseu . Examinarea histopatologică se face pe specimene de țesut fixate în formalină și incluse în parafină în proporție de 10%, ceea ce reprezintă o resursă neprețuită pentru cercetarea clinică, deși acizii nucleici extrași sunt fragmentați și modificați chimic, ceea ce face dificilă utilizarea lor în studiile moleculare . Observațiile histopatologice sunt utilizate în ceea ce privește progresia, susceptibilitatea la metastaze, sensibilitatea terapeutică și la radioterapie și prognosticul . Interesant este faptul că tehnica neinvazivă a spectroscopiei Raman permite observarea moleculelor biologice intracelulare fără proceduri de fixare sau de etichetare in situ .

Testul de cuantificare a proteinelor din kitul de acid bicinchoninic care este utilizat pe scară largă pentru a determina concentrațiile de proteine în regiunea 25-2000 μg/ml. Celulele sunt suspendate și lizate în tampon hipotonic (20 mM Tris-HCl 20 mM , 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM ZnCl2 conținând 1% Triton X-100) timp de 5 min la gheață; apoi au fost separate în fracțiuni nucleolare și nucleoplasmatice prin centrifugare zonală în zaharoză la 15.000 rpm timp de 15 min la 4°C, iar supernatantul a fost colectat și congelat la -20°C până la reutilizare . Această metodă este o formă modificată a metodelor Lowry et al. și Bradford, care sunt, de asemenea, teste de variație a proteinelor cromogenice cu legare de coloranți utilizate pe scară largă. Testul proteic Bradford se bazează pe asocierea reziduurilor specifice de aminoacizi, arginină, lizină și histidină, cu grupe neconjugate de colorant albastru strălucitor Coomassie G-250, într-un mediu acid. Atunci când se formează complexul colorant-proteină, pKa-ul soluției acide de culoare roșu-maroniu se transformă în albastru și se măsoară la 595 nm. Colorantul Bradford este un protocol convenabil de utilizat, rapid și relativ sensibil, dar mai mulți compuși pot interfera cu testul față de curbele standard tipice pentru seroalbumina bovină și gamaglobulina bovină . Celălalt test de testare a proteinelor Lowry et al. constă în formarea complexului de azot(e) peptidic(e) cu Cu2+ în condiții alcaline (pH 10,0-10,5) și reducerea ulterioară a reactivului de acid fosfomolibdic fosfotungstic Folin-Ciocalteay la albastru de heteropolimolibden la spectru 750 nm, deși acidul etilendiaminetetraacetic (EDTA) poate interfera cu producerea de cromofori .

Radio-imunohistochimia este o tehnică in vitro foarte sensibilă în care un izotop radioactiv trasabil marchează un marker pentru a detecta, identifica și cuantifica concentrația substanței (substanțelor) specifice neoplaziei ochimice . Radioimunomasajul a fost dezvoltat pentru a identifica și cuantifica concentrația de ARN polimeraza I , ARN polimeraza II , ARN polimeraza III și ARNm . Deși este mai puțin sensibilă decât activitatea enzimatică ca măsură a transcriptazei inverse, dar poate detecta antigenul folosind cantități infime de proteină și în prezența inhibitorilor pentru un ARN al celulelor producătoare de virusuri tumorale .

Cele trei ARN polimeraze transcriu genomul în nucleele celulelor. ARN polimeraza II care este responsabilă pentru sintetizarea ARNm și a unei mari varietăți de ARN-uri necodificatoare, este cea mai importantă; producția de ARN în celulele în creștere este realizată de ARN polimeraza I care transcrie precursorul ARNr mare și de ARN polimeraza III care transcrie ARNr, ARNt și unele ARN-uri necodificatoare . Hossenlopp și colab. au folosit serul anti-polimeraza I pentru a clasifica cele trei ARN polimeraze în ordinea inhibării lor: I > III > I, ceea ce indică faptul că polimerazele I și II sunt mai strâns înrudite decât polimerazele I și II .

Constatări și interpretări

Efectul diferențiat al inhibiției selective asupra sistarea ARN-ului nuclear și nucleoplasmatic este legat de existența unor ARN polimeraze nucleare și cromozomiale distincte care determină răspunsuri biochimice și morfologice de tip mitotic. De asemenea, se demonstrează că sinteza ribozomilor în celulele HeLa este controlată mai degrabă la nivelul procesării decât la nivelul transcripției ARN 45S, unde agenții chimici ar provoca tranzițiile fiziologice și structurale ale mitozei virale. Tabelul 2 enumeră unii dintre acești agenți terapeutici care pot fi considerați ca interferând cu procesul de replicare a virusului.

În concluzie, apariția secvențierii genomului uman a facilitat progresele impresionante în diagnosticul, prognosticul și metodologiile de tratament al celulelor tumorale umane invazive. Un nou domeniu de cercetare a agenților chimici care interferează cu moartea celulară legată de mitoză (apoptoză), sunt capabili să denatureze celulele neoplazice rezistente la chimioterapie și să inhibe expresiile proteice. Giri și Kumar au raportat că supraexpresia neo-poly (A) polimerazei în celulele canceroase umane semnifică importanța poliadenilării în evenimentele celulare canceroase. S-a constatat că specificitatea unei interacțiuni electrostatice între ARN și alcaloizi naturali sau analogii sintetici ai acestora este capabilă să inducă auto-structura în poliadenelare. Prin urmare, noii compuși noi, care prezintă o afinitate de legare excelentă pentru multe structuri de ARN, pot fi utilizați pentru a modula structura poli(A) în dezvoltarea de terapii oncologice orientate spre ARN. Nanoparticulele de aptameri sunt, de asemenea, în curs de apariție pentru a viza reacția epitopilor antigenici specifici cu situsurile lor de legare. Acestea sunt tehnici promițătoare în diagnosticul și terapia clinică. Astfel de noi cunoștințe despre genetica tumorilor au dus la descoperiri revoluționare în dezvoltarea de noi medicamente care pot trata, micșora și convinge tumorile date să intre în remisiune prelungită.

.

Lasă un comentariu