Biosynteza kwasu rybonukleinowego (RNA) w nowotworach człowieka

Rudolf Virchow (1821-1902) jest powszechnie uznawany za pierwszego, który rozpoznał komórki białaczki, a Fridrich Miescher (1844-1895) zidentyfikował i wyizolował substancję komórkową zawierającą azot i fosfor, natomiast Albrecht Kossel (1853-1927) wyizolował kwasy nukleinowe: dwie puryny (adenina i guanina) oraz trzy pirymidyny (tymina, cytozyna i uracyl) . Rak jest jednak definiowany jako grupa ponad 100 różnych chorób, które są spowodowane przez liczne zmiany w komórkowym DNA i RNA, i charakteryzuje się niekontrolowanym wzrostem (mitoza), w którym komórki są agresywne, inwazyjne i czasami przerzutowe. Również odkrycie podwójnej helisy cząsteczki DNA przez Watsona i Cricka było dodatkowym kamieniem milowym w nauce XX wieku (rysunek 1). Materiał genetyczny organizmów żywych i podwójna helisa cząsteczki DNA stały się podstawą nowej dyscypliny naukowej, jaką jest biologia molekularna.

Rysunek 1

Istotne jednoniciowe kwasy nukleinowe RNA i dwuniciowe kwasy nukleinowe DNA.

Pełny skręt podwójnej helisy DNA obejmuje dziesięć par zasad, które pokonują odległość 34 Ǻ (3,4 nm). Poszczególne pary zasad są oddalone od siebie o 34 Ǻ (3,4 nm). W miejscach przecięcia nici ukryte są pary zasad, które rozciągają się prostopadle do patrzącego. Średnica wewnętrzna wynosi 11 Ǻ (1,1 nm), a zewnętrzna 20 Ǻ (2,0 nm). Wewnątrz cylindrycznego zarysu podwójnej helisy znajdują się dwa rowki, które są wystarczająco duże, aby pomieścić łańcuchy polipeptydowe. Największy chromosom człowieka, chromosom numer 1, składa się z około 220 milionów par zasad i ma długość 85 nm. Znaki minus obok nici podwójnej helisy oznaczają wiele ujemnie naładowanych grup fosforanowych na całej długości każdej nici. W przeciwieństwie do dwuniciowego DNA, RNA jest cząsteczką jednoniciową w wielu swoich biologicznych rolach i ma znacznie krótszy łańcuch nukleotydów. Jednakże RNA może, poprzez komplementarne parowanie zasad, tworzyć wewnątrzłańcuchowe podwójne helisy, jak w przypadku tRNA. Podczas gdy DNA zawiera deoksyrybozę, RNA zawiera rybozę (w deoksyrybozie nie ma grupy hydroksylowej przyłączonej do pierścienia pentozowego w pozycji 2′). Te grupy hydroksylowe sprawiają, że RNA jest mniej stabilne niż DNA, ponieważ jest bardziej podatne na hydrolizę. Zasada komplementarna do adeniny nie jest tymina, jak to jest w DNA, ale raczej uracyl, który jest nunmetylowana forma tyminy.

Przyjęte z: Watson J.D. i Crick, F.H.C. (1953) „Molekularna struktura kwasu nukleinowego. A structure of deoxyribosenucleic acid”, Nature, vol.171, pp.737-738; Gregory, S., Barlow, K.F., McLay, K.E., Kaul, R., Swarbreck, D., Dunham, A., Scott, C.E., Howe, K.L. and Woodfine, K. (2006). „The DNA sequence and biological annotation of human chromosome 1”. Nature, vol. 441 (7091), pp.315-221; Nelson, D.L. and Cox, M.M. (2008) Lehninger Principles of Biochemistry, 5th edn, pp.277-287. New York, NY: W.H. Freeman and Company.

Szczegółowy mechanizm, dzięki któremu taki materiał genetyczny mógł zostać wyrażony jako białka strukturalne i katalityczne, które odgrywają tak ważną rolę w funkcjonowaniu wszystkich żywych komórek, wciąż nie był oczywisty . Stanley miller (1930-2007) i Harold Urey (1893-1981) zaprojektowali eksperyment, który symulował hipotetyczne warunki uważane za obecne w czasie wczesnego życia na Ziemi i testował jakościowo na występowanie ziemskich związków chemicznych, które zapoczątkowały życie. Podstawowe elementy chemiczne H2, CH4, H2O i NH3, które były zamknięte w sterylnych szklanych kolbach i probówkach, zostały poddane wyładowaniom elektrycznym, a w wyniku interakcji powstało 20 aminokwasów, budulec białek, jak również inne związki organiczne, takie jak: adenozynotrójfosforan, lipidy, niektóre cukry i podstawy RNA i DNA (Lazcano i Bada ).

Crick i wsp. zaprojektowali elegancką strategię eksperymentalną w celu określenia natury kodu genetycznego, która okazała się nadzwyczaj poprawna pomimo braku technologii umożliwiającej analizę i porównanie sekwencji DNA i białek. Kod genetyczny jest relacją pomiędzy sekwencją zasad w DNA (lub jego transkryptach RNA) a sekwencją aminokwasów w białkach. Cechy kodu genetycznego są następujące: (1) trzy nukleotydy kodują aminokwas, (2) kod jest nienakładający się, (3) kod nie ma interpunkcji, i (4) kod genetyczny jest zdegenerowany .

Prolina tylko różni się od tej podstawowej struktury, ponieważ zawiera niezwykły pierścień do N-końcowej grupy aminowej, który zmusza amidową cząsteczkę CO-NH do stałej konformacji . Po dokonaniu tego koncepcyjnego przełomu, skomplikowane zadanie rozwikłania wielu etapów biosyntezy białka mogło rozpocząć się w laboratorium. Sekwencja aminokwasów w białku jest określona przez gen i zakodowana w kodzie genetycznym. Chociaż ten kod genetyczny określa 20 różnych L-α-aminokwasów, reszty w białku są często chemicznie zmienione w modyfikacji posttranslacyjnej: albo zanim białko może funkcjonować w komórce, albo jako część mechanizmów kontrolnych .

Geny są zbudowane z kwasów nukleinowych, które zawierają instrukcje tworzenia białek; enzymy są również zbudowane z białek i są potrzebne do replikacji genów .

Informacja genetyczna zakodowana w dwóch komplementarnych niciach DNA każdego genu strukturalnego jest transkrybowana przez enzym zwany polimerazą RNA zależną od DNA, który katalizuje syntezę RNA z szablonu DNA lub RNA . Eukariotyczne polimerazy RNA (pol-I, pol-II i pol-III) są centralnymi maszynami wielobiałkowymi. Polimeraza RNA zależna od DNA tworzy jednoniciową kopię RNA, komplementarną do jednej z nici, które nazywane są mRNA. Ten przyłącza się do organelli subkomórkowej rybosomu, który składa się z dwóch podjednostek o średnicy między 25 a 30 nm (250-300 Å) ze stosunkiem rRNA do roteiny bliskim 1 . Działa on jak czarna skrzynka, na której mRNA jest tłumaczone. Termin translacja obejmuje wszystkie etapy, w których zawartość genetyczna mRNA zawarta w liniowej sekwencji rybonukleotydów jest przekształcana w liniową sekwencję aminokwasów. Podczas gdy mRNA może być uważany za środek, za pomocą którego informacja genetyczna jest faktycznie przekazywana z genomu (DNA) i umieszczana w odpowiednich miejscach cytoplazmatycznych w celu przekształcenia w białko. Biogeneza i utrzymanie organelli wymaga nowo syntetyzowanych białek, z których każdy musi przejść od rybosomu tłumaczącego jego mRNA do prawidłowej translokacji do subkompleksu organelle . Co ciekawe, wykazano, że fat and obesity-associated gene is located on chromosome 16 of mRNA demethylase , i.e. methylation of mRNA plays a critical role in human energy homeostasis .

The nucleic acids are assembled from individual nucleotides just as proteins are assembled from individual amino acids. Nukleotydy są syntetyzowane przez szereg reakcji pośredniczonych przez enzymy. Biochemiczne szlaki są oddzielnie prowadzone do syntezy rybozy i różnych zasad, które są następnie montowane w celu utworzenia trifosforanów nukleotydów . Niosąca energię cząsteczka ATP, która składa się z zasady adeniny, rybozy i trzech grup fosforanowych jest również jednym z nukleotydowych bloków budulcowych używanych w syntezie RNA, a pozostałe to trifosforan guanozyny, trifosforan cytydyny i trifosforan urydyny. Nukleotydy te są zwykle syntetyzowane przez przeniesienie energii z ATP do ich form difosforanowych nukleotydów . Tak więc, istnieje ogólna pula trifosforanów nukleotydów, które działają jako elementy konstrukcyjne dla RNA w komórce . Te wolne nukleotydy zmontowane w liniowej sekwencji, gdzie cząsteczka RNA zawiera niektóre z zakodowanych informacji, które są obecne w DNA, a kiedy DNA jest kopiowany do mRNA za pomocą parowania zasad adenina-tymina i guanina-cytozyna jest proces transkrypcji DNA . Podczas syntezy mRNA, wiązania między tymi parami w DNA, adenina-tymina i guanina-cytozyna, a dwuniciowa struktura częściowo się odwija i dwie nici oddzielają się. Zasady wolnych trifosforanów nukleotydów i zasady w jednym z rozdzielonych łańcuchów DNA tworzą nowe wiązania. DNA działa więc jak szablon, który nakazuje sekwencję zasad w RNA. Zasada adenina w wolnym nukleotydzie łączyłaby się w pary z zasadą tymina w DNA, a zasada uracyl w wolnym nukleotydzie również łączyłaby się w pary z zasadą adenina w DNA. Podobnie, cytozyna w wolnym nukleotydzie paruje się z guaniną w DNA, a guanina w wolnym nukleotydzie paruje się z cytozyną w DNA. Wynikiem tego będzie nowa sekwencja zasad w RNA, która jest enancjomerycznym lustrzanym odbiciem sekwencji zasad w DNA. Ponieważ podstawową zaletą parowania zasad nukleotydów jest to, że dwie nici DNA mogą się łatwo i dokładnie replikować, każda zasada może parować się tylko z jedną inną zasadą (tymina z adeniną, adenina z tyminą, cytozyna z guaniną i guanina z cytozyną). Tak więc, jeśli oryginalny kodon DNA zawiera sekwencję zasadową cytozyna-guanina-tymina, komplementarną sekwencją kodonu w mRNA jest guanina-cytozyna-adenina.

Po tym, jak odpowiednie wolne trifosforany nukleotydów są sparowane z odpowiednimi zasadami w DNA, nukleotydy są łączone ze sobą przez enzym polimerazę RNA II (12 podjednostek), który powoduje odłączenie pirofosforanu od trifosforanu nukleotydu w procesie łączenia jednego nukleotydu z następnym, tworząc szkielet cukrowo-fosforanowy mRNA. Enzym ten jest aktywny tylko w obecności DNA i nie łączy wolnych trifosforanów nukleotydów ze sobą w przypadku jego braku. Enzym porusza się wzdłuż nici DNA, łącząc po jednym nukleotydzie w rosnący łańcuch mRNA. Aktywność RNA-polimerazy II jest zależna od DNA, co oznacza, że musi ona mieć cząsteczkę szablonu DNA, zanim będzie mogła syntetyzować transkrypt RNA. Polimeraza zależna od DNA musi również posiadać Mg2+ i 5′ trifosforany rybonukleozydów, aby móc przeprowadzić syntezę RNA. Polimeraza RNA tworzy nową nić RNA od 5′ do 3′ .

Ekspresja białka jest określona przez szybkość transkrypcji i przez procesy posttranskrypcyjne, które prowadzą do zmian w transporcie mRNA, stabilności i wydajności translacji . W tych procesach potranskrypcyjnych pośredniczą modyfikacje RNA, struktura drugorzędowa, mikro RNA (miRNA) oraz białka wiążące RNA, które rozpoznają elementy regulacyjne znajdujące się w 3′ nieulegających translacji regionach transkryptów. Krytyczny proces komórkowy poliadenylacji, który polega na dodaniu ogona poli-(A) do mRNA, odgrywa ważną rolę w wielu aspektach metabolizmu komórkowego mRNA, chociaż rozpoczyna się w momencie zakończenia lub zakończenia transkrypcji genu. Najbardziej 3′ segment nowo powstałego pre-MRNA jest najpierw rozszczepiany przez zestaw białek; białka te następnie syntetyzują ogon poli (A) w jednym z kilku możliwych miejsc. Rozszczepienie generuje wolną grupę 3′-hydroksylową, która definiuje koniec mRNA, do którego reszty adeninowe są natychmiast dodawane przez polimerazę poliadenylanową, która katalizuje reakcję:

$$ \mathrm{R} \mathrm{N} \mathrm{A} + \mathrm{nATP} \Crc ledR\ \mathrm{R} \mathrm{N} \mathrm{A} \hbox{-} {\left(\mathrm{A}\mathrm{M}\mathrm{P}\right)}_{\mathrm{n}} + {\mathrm{n}\mathrm{P}\mathrm{P}}_{\mathrm{i}} $$

gdzie n = 200-250 . Ogon poli-(A) i związane z nim białka są bardziej prawdopodobne, aby ptotect mRNA od zniszczenia enzymatycznego . Geny kodujące białka mogą mieć więcej niż jedno miejsce poliadenylacji, „dodatkowe RNA”, więc gen może kodować kilka mRNA, które różnią się 3′-końcem, chociaż poliadenylacja mRNA jest kontrolowana przez różne elementy cis-działające otaczające miejsce cięcia i ich czynniki wiążące. Ponieważ alternatywna poliadenylacja zmienia długość regionu 3′ nieulegającego translacji, globalne skrócenie regionów 3′ nieulegających translacji poprzez alternatywną poliadenylację jest pojawiającą się cechą charakterystyczną raka; może to również zmienić miejsca wiązania dla miRNA, które zawiera region 3′ nieulegający translacji. Tak więc, poliadenylacja jest sposobem znakowania RNA do degradacji dla wielu niekodujących RNA, w tym tRNA, rRNA, snRNA i snoRNA. Egzosom RNA (30-100 nm) jest konserwowaną maszynerią degradacyjną, która uzyskuje pełną aktywność tylko wtedy, gdy jest związana z kofaktorami; ogony poli (A) zostały znalezione na ludzkich fragmentach RNA zarówno z homopolimerycznymi, jak i w większości heterpolimerycznymi ogonami. Regulowana poliadenylacja specyficznych mRNA jest zaangażowana w oogenezę, progresję cyklu komórkowego i plastyczność synaptyczną. Coraz częściej okazuje się, że wiele czynników transaktywujących poliadenylację, w tym polimeraza poliadenylanowa, jest zaangażowanych w cykl komórkowy, apoptozę i prognozowanie nowotworów. Tak więc, geny ulegające alternatywnemu rozszczepieniu i poliadenylacji podczas progresji nowotworów u ludzi mogą być użytecznymi nowymi biomarkerami i potencjalnie ukierunkowanymi na zapobieganie i leczenie chorób .

Mikro RNA są endogenną klasą regulatorów potranskrypcyjnych, które regulują aż jedną trzecią ludzkich genów; są one małej długości (fragmenty o długości 21-25 nukleotydów) i jednoniciowe . Badania sugerują, że około połowa znanych mikroRNA znajduje się w nie kodujących białek RNA (intron i ekstron) lub w intronie genów kodujących białka. Mogą one rozpoznawać i wiązać się z niedoskonałymi sekwencjami komplementarnymi parowania zasad w 3′-nieulegającym translacji regionie wielu docelowych mRNA, blokując translację ekspresji genu lub indukując rozszczepienie mRNA w celu kontrolowania wielu krytycznych procesów poprzez zmniejszenie lub zahamowanie wydajności translacji docelowego mRNA. Ostatnie badania wykazały, że miRNA są nieprawidłowo wyrażone w różnych chorobach człowieka, od raka do przerostu układu sercowo-naczyniowego. Mikro RNA są ukierunkowane na ~60% wszystkich genów i są obficie obecne w celu represji 100 s celów we wszystkich komórkach ludzkich; bioinformatyka wskazuje, że 22 nukleotydowy jednoniciowy RNA składający się z 4 różnych rybonukleotydów, może mieć ponad 1013 możliwych kombinacji sekwencji. Tak więc, skoro komórka zawiera typowo ~1049 miRNA, musi istnieć bardzo duża rozwojowa i ewolucyjna presja selekcyjna, która wykorzystuje tylko specyficzne sekwencje oligonukleotydów miRNA w celu uzyskania biologicznie użytecznych interakcji miRNA-mRNA. Biogeneza miRNA przebiega podobnie jak innych RNA, począwszy od transkrypcji DNA. Pierwotne miRNA jest niezależnym transkryptem przetwarzanym przez polimerazę RNA II i jest wiązane w jądrze przez kompleks „mikroprocesorowy”, który składa się z rybonukleazy III (endonukleazy zależnej od Mg2+), Drosha i jego kofaktora Pasha (DGCR8). Wytwarzanie dojrzałych miRNA z prekursorowych miRNA przez kompleks rybonukleaza III (Dicer1 /TRBP w cytoplazmie . Dicer jest wyspecjalizowaną rybonukleazą, która inicjuje interferencję RNA przez rozszczepianie dwuniciowego RNA na fragmenty miRNA, a TRBP (ludzki wirus niedoboru odporności transaktywujący odpowiedź na białko wiążące dwuniciowe RNA) jest integralnym składnikiem kompleksu zawierającego Dicer .

Neoplazja, która obejmuje wiele chorób, jest nieprawidłowością różnicowania komórkowego, dojrzewania i kontroli wzrostu. Rupert Allan Willis (1898-1980) zdefiniował nowotwór jako „nieprawidłową masę tkanki, której wzrost przekracza i jest nieskoordynowany z otaczającymi ją normalnymi tkankami i utrzymuje się w ten sam nadmierny sposób po ustaniu bodźców, które wywołały zmianę” i ta definicja jest powszechnie cytowana. Wykazano również, że kilka chorób nowotworowych i nienowotworowych zawiera krążące kwasy nukleinowe, a w nowotworach pochodzą one głównie z guza. Stąd, poziom krążących kwasów nukleinowych, które zostały związane z obciążeniem guza i progresji nowotworu, są wykorzystywane do badań przesiewowych raka, rokowanie i monitorowanie skuteczności terapii przeciwnowotworowej .

Also, Conrad H. Waddington (1905-1975) zgłosił skomplikowaną interakcję między środowiskiem komórkowym i genów wpływ na determinację fenotypu; przypisał sygnały molekularne do zjawiska epigenetycznego . Sygnały epigenetyczne, które są odpowiedzialne za ustanowienie, utrzymanie i odwrócenie metastabilnych stanów transkrypcyjnych, mają bezpośredni związek z hipermetylacją promotora i wyciszonych genów supresorowych nowotworów, czynników transkrypcyjnych upstream i enzymów naprawy DNA. Ponieważ rak jest ostatecznie choroba genów, mechanizm, w którym informacje epigenetyczne są przekazywane przez podział komórki pozostają niejasne, jak złożone stany epigenetyczne są orkiestrowane przez kilka zbieżnych sygnałów .

Biologicznie aktywne RNA, w tym mRNA, tRNA, rRNA, małe nukleinowe RNA i inne niekodujące RNA , zawierają sekwencje samokomplementarne, które pozwalają części RNA do składania i pary z sobą, aby utworzyć podwójne heliksy (rysunek 2).

Rysunek 2

Podstawy procesu przekazywania informacji w komórkach.

Analiza tych RNA ujawniła, że są one wysoce ustrukturyzowane i nie składają się z długich podwójnych heliksów, ale raczej ze zbiorów krótkich heliksów upakowanych razem w struktury podobne do białek. RNA składane i zgodne z katalizą chemiczną enzymów, na przykład, aktywne miejsce rybosomu, który analizuje tworzenie i uwalnianie wiązań peptydowych składa się w całości z RNA. rRNA jest niezbędny jako składnik strukturalny rybosomów, na których faktycznie zachodzi translacja, a tRNA jest wymagany w aktywacji aminokwasów, jako adaptor w specyfikacji aminokwasów skierowanej na mRNA oraz w wiązaniu rosnących łańcuchów białkowych z rybosomami (rys. 2). W procesie transkrypcji DNA rozmieszczenie jednostek nukleotydowych w tworzonych cząsteczkach RNA jest kontrolowane przez DNA, który pełni rolę szablonu. Sposób, w jaki ten szablon dyktuje taką sekwencję, obejmuje zarówno interakcje parowania zasad, jak i specyficzne oddziaływania między białkami i kwasami nukleinowymi. Każdy łańcuch RNA jest inicjowany w określonym miejscu na szablonie DNA i podlega zakończeniu w innym, unikalnym miejscu na szablonie, czyli istnieją określone jednostki transkrypcji. Jest to proces selektywny. Specyficzne sygnały w szablonie DNA są rozpoznawane przez aparat transkrypcyjny. Inicjacja jest regulowana przez regiony promotorowe w DNA, a region regulujący zakończenie jest określany jako terminator .

(1) Transkrypcja: Informacja zakodowana w sekwencji nukleotydów DNA jest transkrybowana poprzez syntezę mRNA, którego sekwencja jest podyktowana sekwencją DNA. (2) Translacja: Ponieważ sekwencja mRNA jest dekodowana przez maszynerię syntezy białek, jest ona tłumaczona na sekwencję aminokwasów w białku. Ten transfer informacji jest zamknięty w dogmacie: DNA → RNA → Białko.

Adopted from: Hernández, G. (2012) On the Emergence and Evolution of the Eukaryotic Translation Apparatus, in Cell-Free Protein Synthesis, Biyani, M. (ed.), p.32. Retrieved September13, 2014 from http://cdn.intechopen.com/pdfs-wm/39965.pdf.

Archibald Garrod (1857-1936) był jednym z pierwszych naukowców, którzy zaproponowali, że dziedziczone czynniki (geny) kontrolowały funkcję białek . Defekty (choroby) w metabolizmie mogą być związane z niepowodzeniem konkretnych enzymów do katalizowania istotnych reakcji biochemicznych. Synteza białek, translacja, jest kierowana przez cząsteczkę mRNA. Translacja może być postrzegana jako zachodząca w dwóch fazach: (1) przekazywania informacji, w której sekwencja zasad RNA w mRNA określa sekwencję aminokwasów oraz (2) procesów chemicznych, w których powstają wiązania peptydowe pomiędzy sąsiadującymi aminokwasami. Składniki niezbędne do translacji to: mRNA, rybosomy (60S i 40S), tRNA, syntetazy aminoacylo-tRNA oraz białka pomocnicze biorące udział w inicjacji, elongacji i terminacji. Można sądzić, że wydłużanie obejmuje trzy procesy: (1) wyrównanie każdego aminoacylowanego tRNA, (2) utworzenie wiązania peptydowego w celu dodania nowego aminokwasu do łańcucha polipeptydowego oraz (3) przesunięcie rybosomu wzdłuż mRNA o kolejne trzy zasady (jeden kodon). Elongacja przebiega do momentu osiągnięcia kodonu stop. W kodzie genetycznym występują trzy kodony stop: UAG, UGA, UAA .

Wyjątkowo trudno jest ocenić rakotwórcze działanie tak wielu substancji chemicznych stosowanych w rolnictwie, przemyśle i gospodarstwie domowym, ale znaczne zagrożenie stwarza usuwanie różnych odpadów rolniczych i przemysłowych, które mogą zanieczyszczać wodę pitną, wody przybrzeżne i zanieczyszczenie życia morskiego . Ponadto, identyfikacja chemicznego czynnika rakotwórczego jest problematyczna ze względu na długi okres czasu pomiędzy narażeniem na działanie chemikaliów a rozwojem raka, chyba że efekt jest dramatyczny. Ze względu na ogromną liczbę substancji chemicznych, z którymi ludzie zetknęli się w ciągu swojego życia, w tabeli 1 przedstawiono najsilniej udowodnione rakotwórcze substancje chemiczne.

Tabela 1 Główne chemiczne czynniki rakotwórcze u ludzi

Wirus jest ultramikroskopijnym wirusem owiniętym w ochronną powłokę białkową, czynnikiem zakaźnym, obligatoryjnym pasożytem wewnątrzkomórkowym, którego replikacja zależy od jego rdzenia DNA lub RNA i procesu syntezy białek komórki gospodarza dla wzrostu w kulturze tkankowej. Do głównych patogennych wirusów należą: adenowirusy, flawiwirusy, hepadnawirusy, herpeswirusy, homyksowirusy, papawirusy, paramyksowirusy, pikornawirusy, poliomawirusy, ortomyksowirusy, rabdowirusy i togawirusy. Infekcja wirusowa powszechnie osiąga optymalny czas w funkcji replikacji, gdy pojawiają się objawy kliniczne, a replikacja składa się z następujących etapów: (1) przyłączenie do i penetracja podatnej komórki, (2) demontaż białek niestrukturalnych w celu udostępnienia kwasu nukleinowego do namnażania wirusa, (3) synteza RNA lub DNA poprzez transkrypcję i translację (rysunek 2), (4) synteza białek strukturalnych i funkcjonalnych oraz (5) montaż i uwolnienie dojrzałych cząstek wirusowych z komórki . Tabela 2 przedstawia chemiczne środki przeciwwirusowe, które klinicznie blokowałyby replikację wirusa, gdy są podawane na początku choroby, czyli w ramach chemoprofilaktyki.

Tabela 2 Środki przeciwwirusowe i niektóre z ich właściwości

Metodologia

Na zakażenie, wirusowe RNA przenika przez błony komórkowe ludzkiego gospodarza, gdzieupon jest albo zniszczone przez kilka komórkowych RNases , lub wiąże się z rybosomów i rośnie i dzieli się, aby białka w nieuregulowanym przyspieszonym tempie . Proces cyklu transkrypcyjnego, na który składają się: preinicjacja, inicjacja, uwolnienie promotora, elongacja i terminacja, ma istotny wpływ na potencjał wzrostowy nowotworów. Niepowodzenie komórki gospodarza w rozpoznaniu i zniszczeniu infekcji wirusowej spowodowane jest brakiem określonych cząsteczek współstymulujących, które pomagają w sposobie reagowania antygenów z limfocytami. Dlatego też podstawowe badania nad rakiem obejmują identyfikację przyczyn i opracowanie strategii zapobiegania, diagnozowania, leczenia i wyleczenia. Badania obejmują chemioterapię, terapię hormonalną, terapię immunologiczną, nanomateriały, chirurgię paliatywną, radioterapię i metody leczenia skojarzonego; a metody oceny były głównie: (1) metody cytologiczne (cytologia złuszczająca i aspiracyjna), (2) cytometria przepływowa, (3) metody histologiczne, (4) immunohistochemia, (5) diagnostyka molekularna (aptamery), (6) markery nowotworowe (hormony (kalcytonina, metabolity katecholamin, ektopowa, ludzka przewlekła gonadotropina kosmówkowa-HCG), antygeny onkofetalne (białko płodowe α, antygen embrionalny carcino), izoenzymy, specyficzne białka, mucyny i glikoproteiny, nowe markery molekularne).

RNA fagowe każdego etapu syntezy białka, które mogłyby być możliwe do kontrolowania, świadczy o indywidualnej, wzajemnie powiązanej biosyntezie danego białka. Szybkość tworzenia kompleksu inicjacji dyktuje ilość każdego z białek wirusowych . Polimerazy RNA rozpoczynają replikację wirusowego RNA, proces najbardziej centralnych mediatorów przemiany złośliwej . Polimeraza RNA I , polimeraza RNA II i polimeraza RNA III transkrybują geny kodujące białka i współdziałają z czynnikami zaangażowanymi w syntezę prekursora rRNA 45S, przebudowę chromatyny, aktywację transkrypcji, elongację i przetwarzanie RNA.

Wielokomórkowe eukariotyczne enzymy ludzkie mogą być oczyszczane przy użyciu izolowanych organelli, takich jak jądro, jąderka, mitochondria i inne organelle wewnętrzne jako materiał wyjściowy, chociaż jednoczesne odzyskiwanie wszystkich trzech polimeraz RNA nie zawsze jest wykonalne ze względu na dyfuzyjny charakter niektórych enzymów jądrowych. Jacob i Rose dokonali obszernego przeglądu metod solubilizacji, oczyszczania i trudności polimeraz RNA ssaków.

Komórki HeLa były często źródłem kompleksów polimerazy RNA; komórki mitotyczne i tkanki nowotworowe z odpowiadającymi im normalnymi tkankami, które można zebrać i zamrozić w ciekłym azocie w temperaturze -80°C, są żywotnie zachowane do czasu badania . Badanie histopatologiczne jest wykonywane na 10% utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie próbkach tkanek, co jest nieocenionym źródłem dla badań klinicznych, chociaż wyodrębnione kwasy nukleinowe są pofragmentowane i chemicznie zmodyfikowane, co czyni je trudnymi do wykorzystania w badaniach molekularnych. Obserwacje histopatologiczne są wykorzystywane w progresji, podatności na przerzuty, wrażliwości na terapię i radioterapię oraz rokowaniu. Co ciekawe, nieinwazyjna technika spektroskopii ramanowskiej umożliwia obserwację wewnątrzkomórkowych cząsteczek biologicznych bez utrwalania lub procedur etykietowania in situ.

Zestaw do oznaczania ilościowego białka kwasu bicynchoninowego, który jest szeroko stosowany do określania stężenia białka w regionie 25-2000 μg/ml. Komórki są zawieszone i lizowane w buforze hipotonicznym (20 mM Tris-HCl , 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM ZnCl2 zawierającym 1% Triton X-100) przez 5 min na lodzie; następnie zostały rozdzielone na frakcje jąderkowe i nukleoplazmatyczne przez wirowanie strefowe w sacharozie przy 15 000 rpm przez 15 min w 4°C, a supernatant został zebrany i zamrożony w temperaturze -20°C do ponownego użycia . Metoda ta jest zmodyfikowaną formą metody Lowry’ego et al. i metody Bradforda, które są również szeroko stosowanymi testami chromogenicznych odmian białek wiążących barwniki. Test białkowy Bradforda opiera się na asocjacji specyficznych reszt aminokwasowych, argininy, lizyny i histydyny, z niesprzężonymi grupami barwnika błękitu brylantowego Coomassie G-250, w środowisku kwaśnym. Po utworzeniu się kompleksu barwnik-białko, pKa czerwono-brązowego kwaśnego roztworu zmienia się na niebieskie i jest mierzone przy długości fali 595 nm. Barwnik Bradforda jest wygodny w użyciu, szybki i stosunkowo czuły, ale kilka związków może zakłócać oznaczenie w stosunku do typowych krzywych wzorcowych dla albuminy surowicy bydlęcej i gamma globuliny bydlęcej. Inny test białkowy Lowry’ego i wsp. polega na tworzeniu kompleksu azotu peptydowego z Cu2+ w warunkach zasadowych (pH 10,0-10,5), a następnie redukcji odczynnika kwasu fosfomolibdenowego Folin-Ciocalteay do błękitu heteropolimolibdenowego przy widmie 750 nm, chociaż kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) może zakłócać wytwarzanie chromoforu.

Radioimmunohistochemia jest bardzo czułą techniką in vitro, w której wykrywalny izotop promieniotwórczy oznacza znacznik do wykrywania, identyfikacji i ilościowego określania stężenia specyficznej substancji ochemicznej nowotworu (s) . Radioimmunoassay został opracowany w celu identyfikacji i ilościowego określenia stężenia polimerazy RNA I , polimerazy RNA II , polimerazy RNA III i mRNA . Chociaż jest mniej czuły niż aktywność enzymatyczna jako środek odwrotnej transkryptazy, ale może wykryć antygen przy użyciu minutowych ilości białka i w obecności inhibitorów dla komórek produkujących wirusy nowotworowe RNA .

Trzy polimerazy RNA transkrybują genom w jądrach komórkowych. Polimeraza RNA II, która jest odpowiedzialna za syntezę mRNA i dużej różnorodności niekodujących RNA, jest najważniejsza; produkcja RNA w rosnących komórkach jest prowadzona przez polimerazę RNA I, która transkrybuje prekursor dużego rRNA, oraz przez polimerazę RNA III, która transkrybuje rRNA, tRNA i niektóre niekodujące RNA . Hossenlopp i wsp. użyli surowicy anty-polimerazowej I do sklasyfikowania trzech polimeraz RNA w kolejności ich inhibicji: I > III > I, wskazując, że polimerazy I i II są bliżej spokrewnione niż polimerazy I i II .

Wnioski i interpretacje

Zróżnicowany wpływ selektywnej inhibicji na jądrową i nukleoplazmatyczną sysntezę RNA jest związany z istnieniem odrębnych jądrowych i chromosomalnych polimeraz RNA, które powodują podobne do mitotycznych odpowiedzi biochemiczne i morfologiczne. Również synteza rybosomów w komórkach HeLa jest kontrolowana na poziomie przetwarzania, a nie na poziomie transkrypcji 45S RNA, gdzie środki chemiczne spowodowałyby fizjologiczne i strukturalne przejścia wirusowej mitozy. Tabela 2 zawiera listę niektórych z tych środków terapeutycznych, które można uznać za zakłócające proces replikacji wirusa.

W podsumowaniu, pojawienie się sekwencjonowania ludzkiego genomu ułatwiło imponujący postęp w diagnostyce, rokowaniu i metodologii leczenia inwazyjnych ludzkich komórek nowotworowych. Nowy obszar badań nad środkami chemicznymi, które zakłócają śmierć komórki związaną z mitozą (apoptozą), są w stanie denaturować odporne na chemioterapię komórki nowotworowe i hamować ekspresję białek. Giri i Kumar donoszą, że nadmierna ekspresja polimerazy neo-poly (A) w ludzkich komórkach nowotworowych wskazuje na znaczenie poliadenylacji w procesach zachodzących w komórkach nowotworowych. Specyfika elektrostatycznej interakcji pomiędzy RNA a naturalnymi alkaloidami lub ich syntetycznymi analogami wykazuje zdolność do indukowania samostruktury poliadenelacji. W związku z tym, nowe związki, które wykazują doskonałe powinowactwo do wielu struktur RNA, mogą być wykorzystane do modulowania struktury poli (A) w opracowywaniu terapii przeciwnowotworowych ukierunkowanych na RNA. Pojawiają się również nanocząstki aptamerów, których zadaniem jest ukierunkowanie reakcji specyficznych epitopów antygenowych z miejscami ich wiązania. Są to obiecujące techniki w diagnostyce klinicznej i terapii. Takie nowe spojrzenie na genetykę nowotworów spowodowało przełomowe spojrzenie na rozwój nowych leków, które mogą leczyć, kurczyć i nakłaniać dane nowotwory do przedłużonej remisji.

.

Dodaj komentarz