Ribonucleic acid (RNA) biosynthesis in human cancer

Rudolf Virchow (1821-1902) wird allgemein als der erste angesehen, der Leukämiezellen erkannte, und Fridrich Miescher (1844-1895) hatte zelluläre Substanzen identifiziert und isoliert, die Stickstoff und Phosphor enthielten, während Albrecht Kossel (1853-1927) die Nucleinsäuren isolierte: zwei Purine (Adenin und Guanin) und drei Pyrimidine (Thymin, Cytosin und Uracil). Krebs wird jedoch als eine Gruppe von mehr als 100 verschiedenen Krankheiten definiert, die durch mehrfache Veränderungen der zellulären DNA und RNA verursacht werden und durch unkontrolliertes Wachstum (Mitose) gekennzeichnet sind, wobei die Zellen aggressiv, invasiv und manchmal metastatisch sind. Auch die Entdeckung der Doppelhelix des DNA-Moleküls durch Watson und Crick war ein weiterer Meilenstein in der Wissenschaft des zwanzigsten Jahrhunderts (Abbildung 1). Das genetische Material lebender Organismen und die Doppelhelix des DNA-Moleküls bildeten die Grundlage für die neue Disziplin der Molekularbiologie.

Abbildung 1

Die wesentlichen einsträngigen RNA- und zweisträngigen DNA-Nukleinsäuren.

Eine vollständige Windung der DNA-Doppelhelix erstreckt sich über zehn Basenpaare, die eine Strecke von 34 Ǻ (3,4 nm) zurücklegen. Die einzelnen Basenpaare liegen im Abstand von 34 Ǻ (3,4 nm) zueinander. An den Stellen, an denen sich die Stränge kreuzen, verbergen sich Basenpaare, die senkrecht zum Betrachter verlaufen. Der Innendurchmesser beträgt 11 Ǻ (1,1 nm), der Außendurchmesser 20 Ǻ (2,0 nm). Innerhalb des zylindrischen Umrisses der Doppelhelix befinden sich zwei Furchen, die groß genug sind, um Polypeptidketten aufzunehmen. Das größte menschliche Chromosom, Chromosom Nummer 1, besteht aus etwa 220 Millionen Basenpaaren und ist 85 nm lang. Die Minuszeichen neben den Doppelhelixsträngen stehen für viele negativ geladene Phosphatgruppen über die gesamte Länge jedes Strangs. Im Gegensatz zur doppelsträngigen DNA ist die RNA in vielen ihrer biologischen Funktionen ein einzelsträngiges Molekül und hat eine viel kürzere Kette von Nukleotiden. RNA kann jedoch durch komplementäre Basenpaarung Doppelhelixen innerhalb des Strangs bilden, wie z. B. bei tRNA. Während die DNA Desoxyribose enthält, enthält die RNA Ribose (in der Desoxyribose ist keine Hydroxylgruppe an den Pentosering in der 2′-Position gebunden). Diese Hydroxylgruppen machen die RNA weniger stabil als die DNA, da sie anfälliger für Hydrolyse ist. Die komplementäre Base zu Adenin ist nicht Thymin, wie in der DNA, sondern Uracil, eine nicht-methylierte Form von Thymin.

Übernommen aus: Watson J.D. und Crick, F.H.C. (1953) „Molecular structure of nucleic acid. A structure of deoxyribosenucleic acid“, Nature, vol.171, pp.737-738; Gregory, S., Barlow, K.F., McLay, K.E., Kaul, R., Swarbreck, D., Dunham, A., Scott, C.E., Howe, K.L. and Woodfine, K. (2006). „Die DNA-Sequenz und biologische Annotation des menschlichen Chromosoms 1“. Nature, vol. 441 (7091), pp.315-221; Nelson, D.L. and Cox, M.M. (2008) Lehninger Principles of Biochemistry, 5th edn, pp.277-287. New York, NY: W.H. Freeman and Company.

Der detaillierte Mechanismus, durch den das genetische Material in Form von strukturellen und katalytischen Proteinen ausgedrückt werden kann, die für das Funktionieren aller lebenden Zellen eine so wichtige Rolle spielen, war immer noch nicht offensichtlich. Stanley Miller (1930-2007) und Harold Urey (1893-1981) entwarfen ein Experiment, das hypothetische Bedingungen simulierte, von denen man annahm, dass sie zur Zeit des frühen Lebens auf der Erde herrschten, und testeten qualitativ auf das Vorhandensein von irdischen Chemikalien, aus denen das Leben entstand. Die wesentlichen chemischen Elemente H2, CH4, H2O und NH3, die in sterilen Glaskolben und Röhren eingeschlossen waren, wurden elektrischen Entladungen ausgesetzt, und die Wechselwirkung erzeugte 20 Aminosäuren, den Baustein von Proteinen, sowie andere organische Verbindungen wie Adenosintriphosphat, Lipide, einige Zucker und die Basen für RNA und DNA (Lazcano und Bada).

Crick et al. entwarfen eine elegante experimentelle Strategie, um die Natur des genetischen Codes zu bestimmen, die bemerkenswerterweise die richtige war, obwohl es keine Technologie zur Analyse und zum Vergleich von DNA- und Proteinsequenzen gab. Der genetische Code ist die Beziehung zwischen der Basensequenz in der DNA (oder ihren RNA-Transkripten) und der Aminosäuresequenz in den Proteinen. Die Merkmale des genetischen Codes sind wie folgt (1) drei Nukleotide kodieren eine Aminosäure, (2) der Code ist nicht überlappend, (3) der Code hat keine Interpunktion und (4) der genetische Code ist degeneriert.

Prolin unterscheidet sich von dieser Grundstruktur nur dadurch, dass es einen ungewöhnlichen Ring an der N-endigen Amingruppe enthält, der die CO-NH-Amideinheit in eine feste Konformation zwingt. Nach diesem konzeptionellen Durchbruch konnte die komplexe Aufgabe, die vielen Schritte der Proteinbiosynthese zu enträtseln, im Labor beginnen. Die Abfolge der Aminosäuren in einem Protein wird durch ein Gen festgelegt und im genetischen Code kodiert. Obwohl dieser genetische Code 20 verschiedene L-α-Aminosäuren spezifiziert, werden die Reste in einem Protein oft durch posttranslationale Modifikation chemisch verändert: entweder bevor das Protein in der Zelle funktionieren kann oder als Teil von Kontrollmechanismen .

Gene bestehen aus Nukleinsäuren, die die Anweisungen für die Herstellung von Proteinen enthalten; Enzyme bestehen ebenfalls aus Proteinen und werden für die Replikation von Genen benötigt.

Genetische Informationen, die in den beiden komplementären Strängen der DNA eines jeden Strukturgens kodiert sind, werden von einem Enzym namens DNA-abhängige RNA-Polymerase transkribiert, das die Synthese von RNA aus einer DNA- oder RNA-Vorlage katalysiert. Die eukaryotischen RNA-Polymerasen (pol-I, pol-II und pol-III) sind die zentralen Multiproteinmaschinen. Die DNA-abhängige RNA-Polymerase stellt eine einzelsträngige RNA-Kopie her, die komplementär zu einem der Stränge ist, die mRNA genannt werden. Diese wird an ein Ribosom der subzellulären Organelle angehängt, das aus zwei Untereinheiten mit einem Durchmesser von 25 bis 30 nm (250-300 Å) und einem Verhältnis von rRNA zu Rotein von nahezu 1 besteht. Es fungiert als Blackbox, über die die mRNA übersetzt wird. Der Begriff Übersetzung umfasst alle Schritte, durch die der genetische Inhalt der mRNA, der in einer linearen Sequenz von Ribonukleotiden enthalten ist, in eine lineare Sequenz von Aminosäuren umgewandelt wird. Während die mRNA als das Mittel angesehen werden kann, mit dem die genetische Information tatsächlich vom Genom (der DNA) übertragen und an den entsprechenden Stellen im Zytoplasma für die Übersetzung in Protein platziert wird. Für die Organellenbiogenese und -erhaltung sind neu synthetisierte Proteine erforderlich, die jeweils vom Ribosom, das ihre mRNA übersetzt, zur korrekten Translokation in ein Organellenunterkompartiment gelangen müssen. Interessanterweise wurde nachgewiesen, dass das mit Fett und Adipositas assoziierte Gen auf Chromosom 16 der mRNA-Demethylase liegt, d.h. die Methylierung der mRNA spielt eine entscheidende Rolle in der menschlichen Energiehomöostase.

Die Nukleinsäuren werden aus einzelnen Nukleotiden zusammengesetzt, so wie Proteine aus einzelnen Aminosäuren zusammengesetzt werden. Die Nukleotide werden durch eine Reihe von enzymvermittelten Reaktionen synthetisiert. Für die Synthese der Ribose und der verschiedenen Basen, die dann zu Nukleotidtriphosphaten zusammengesetzt werden, werden getrennte biochemische Wege beschritten. Das energietragende Molekül ATP, das aus der Base Adenin, Ribose und drei Phosphatgruppen besteht, ist auch einer der Nukleotidbausteine, die bei der Synthese von RNA verwendet werden, die anderen sind Guanosintriphosphat, Cytidintriphosphat und Uridintriphosphat. Diese Nukleotide werden in der Regel durch die Übertragung von Energie aus ATP auf ihre Diphosphatformen der Nukleotide synthetisiert. Es gibt also einen allgemeinen Pool von Nukleotidtriphosphaten, die in der Zelle als Bausteine für RNA dienen. Diese freien Nukleotide werden zu einer linearen Sequenz zusammengesetzt, wobei das RNA-Molekül einige der kodierten Informationen enthält, die in der DNA vorhanden sind, und wenn die DNA unter Verwendung der Basenpaarung Adenin-Thymin und Guanin-Cytosin in mRNA kopiert wird, handelt es sich um den Prozess der DNA-Transkription. Bei der Synthese der mRNA lösen sich die Bindungen zwischen den Basenpaaren Adenin-Thymin und Guanin-Cytosin in der DNA und die Doppelstrangstruktur teilweise auf, und die beiden Stränge trennen sich. Die Basen der freien Nukleotidtriphosphate und die Basen in einer der getrennten DNA-Ketten bilden neue Bindungen. Die DNA dient also als Vorlage, um die Basenfolge in der RNA zu steuern. Die Base Adenin im freien Nukleotid würde sich mit der Base Thymin in der DNA verbinden, und die Base Uracil im freien Nukleotid würde sich ebenfalls mit der Base Adenin in der DNA verbinden. In ähnlicher Weise paart sich die Base Cytosin im freien Nukleotid mit der Base Guanin in der DNA, und die Base Guanin im freien Nukleotid paart sich mit der Base Cytosin in der DNA . Das Ergebnis wäre eine neue Basensequenz in der RNA, die ein enantiomeres Spiegelbild der Basensequenz in der DNA ist. Da der Hauptvorteil der Nukleotidbasenpaarung darin besteht, dass sich zwei DNA-Stränge leicht und genau replizieren können, kann sich jede Base nur mit einer anderen Base paaren (Thymin mit Adenin, Adenin mit Thymin, Cytosin mit Guanin und Guanin mit Cytosin). Wenn also das ursprüngliche DNA-Codon die Basensequenz Cytosin-Guanin-Thymin enthält, ist die komplementäre Codonsequenz in der mRNA Guanin-Cytosin-Adenin .

Sobald die entsprechenden freien Nukleotidtriphosphate mit den entsprechenden Basen in der DNA basengepaart sind, werden die Nukleotide durch das Enzym RNA-Polymerase II (12 Untereinheiten) miteinander verbunden, das die Abspaltung von Pyrophosphat vom Nukleotidtriphosphat bei der Verknüpfung eines Nukleotids mit dem nächsten bewirkt, wodurch das Zucker-Phosphat-Grundgerüst der mRNA gebildet wird. Dieses Enzym ist nur in Anwesenheit von DNA aktiv und verknüpft die freien Nukleotidtriphosphate in seiner Abwesenheit nicht miteinander. Das Enzym bewegt sich entlang des DNA-Strangs und fügt ein Nukleotid nach dem anderen in die wachsende mRNA-Kette ein. Die Aktivität der RNA-Polymerase II ist DNA-abhängig, d. h. sie benötigt ein DNA-Vorlagenmolekül, bevor sie das RNA-Transkript synthetisieren kann. Die DNA-abhängige Polymerase benötigt außerdem Mg2+ und Ribonukleosid-5′-Triphosphate, um die RNA-Synthese durchführen zu können. Die RNA-Polymerase bildet den neuen RNA-Strang von 5′ zu 3′.

Die Proteinexpression wird durch die Transkriptionsrate und durch posttranskriptionelle Prozesse bestimmt, die zu Veränderungen des mRNA-Transports, der Stabilität und der Übersetzungseffizienz führen. Diese posttranskriptionellen Prozesse werden durch RNA-Modifikationen, Sekundärstrukturen, Mikro-RNAs (miRNAs) und RNA-bindende Proteine vermittelt, die regulatorische Elemente in den 3′ untranslatierten Regionen von Transkripten erkennen. Der kritische zelluläre Prozess der Polyadenylierung, d. h. das Anhängen des Poly(A)-Schwanzes an die mRNA, spielt in vielen Aspekten des zellulären Metabolismus der mRNA eine wichtige Rolle, obwohl er mit dem Ende der Transkription eines Gens beginnt oder diese beendet. Das äußerste 3′-Segment der neu gebildeten Prä-MRNA wird zunächst von einer Reihe von Proteinen abgespalten; diese Proteine synthetisieren dann den Poly(A)-Schwanz an einer von mehreren möglichen Stellen. Die Spaltung erzeugt die freie 3′-Hydroxylgruppe, die das Ende der mRNA definiert, an die sofort Adeninreste durch die Polyadenylat-Polymerase angefügt werden, die die Reaktion katalysiert:

$$ \mathrm{R}\mathrm{N}\mathrm{A} + \mathrm{nATP} \circ ledR\ \mathrm{R}\mathrm{N}\mathrm{A}\hbox{-} {\left(\mathrm{A}\mathrm{M}\mathrm{P}\right)}_{\mathrm{n}} + {\mathrm{n}\mathrm{P}\mathrm{P}}_{\mathrm{i}} $$

mit n = 200-250 . Der Poly(A)-Schwanz und die damit verbundenen Proteine schützen die mRNA eher vor enzymatischer Zerstörung. Protein-kodierende Gene können mehr als eine Polyadenylierungsstelle, „extra RNA“, haben, so dass ein Gen für mehrere mRNAs kodieren kann, die sich in ihrem 3′-Ende unterscheiden, obwohl die mRNA-Polyadenylierung durch verschiedene cis-wirkende Elemente, die die Spaltstelle umgeben, und ihre Bindungsfaktoren kontrolliert wird. Da die alternative Polyadenylierung die Länge der untranslatierten 3′-Region verändert, ist die globale Verkürzung der untranslatierten 3′-Region durch alternative Polyadenylierung ein aufkommendes Merkmal von Krebs; sie kann auch die Bindungsstellen für miRNAs verändern, die die untranslatierte 3′-Region enthält. Die Polyadenylierung ist also eine Möglichkeit, die RNA für den Abbau vieler nichtcodierender RNAs, einschließlich tRNA, rRNA, snRNA und snoRNA, zu markieren. Das RNA-Exosom (30-100 nm) ist eine konservierte Abbaumaschinerie, die ihre volle Aktivität nur in Verbindung mit Cofaktoren entfaltet; Poly(A)-Schwänze wurden auf menschlichen RNA-Fragmenten sowohl mit homopolymeren als auch mit meist heterpolymeren Schwänzen gefunden. Die regulierte Polyadenylierung spezifischer mRNAs ist an der Oogenese, der Entwicklung des Zellzyklus und der synaptischen Plastizität beteiligt. Viele Polyadenylierungsfaktoren, darunter auch die Polyadenylatpolymerase, werden zunehmend mit dem Zellzyklus, der Apoptose und der Krebsprognose in Verbindung gebracht. Daher können Gene, die während der Krebsentwicklung beim Menschen alternativ gespalten und polyadenyliert werden, nützliche neue Biomarker sein und möglicherweise gezielt zur Prävention und Behandlung von Krankheiten eingesetzt werden.

Die Mikro-RNAs sind eine endogene Klasse von posttranskriptiven Regulatoren, die bis zu einem Drittel der menschlichen Gene regulieren; sie sind klein (21-25 Nukleotid lange Fragmente) und einzelsträngig. Studien deuten darauf hin, dass etwa die Hälfte der bekannten microRNA in nicht-proteinkodierenden RNAs (Intron und Extron) oder im Intron von proteinkodierenden Genen vorkommt. Sie können unvollkommene komplementäre Basenpaare in der 3′-untranslatierten Region mehrerer Ziel-mRNAs erkennen und daran binden und so die Translation der Genexpression blockieren oder die Spaltung der mRNA induzieren, um eine Vielzahl kritischer Prozesse zu steuern, indem sie die Translationseffizienz der Ziel-mRNA entweder reduzieren oder hemmen. Jüngste Studien haben gezeigt, dass miRNAs bei verschiedenen menschlichen Krankheiten – von Krebs bis hin zu kardiovaskulärer Hypertrophie – abnormal exprimiert werden. Die mikro-RNAs zielen auf ~60 % aller Gene ab und sind reichlich vorhanden, um 100 s von Zielen in allen menschlichen Zellen zu unterdrücken. Die Bioinformatik zeigt, dass eine 22-Nukleotid-Einzelstrang-RNA, die aus 4 verschiedenen Ribonukleotiden besteht, über 1013 mögliche Sequenzkombinationen haben kann. Da die Zelle also typischerweise ~1049 miRNAs enthält, muss es einen sehr hohen entwicklungs- und entwicklungsbedingten Selektionsdruck geben, der nur spezifische miRNA-Oligonukleotidsequenzen nutzt, um biologisch nützliche miRNA-mRNA-Interaktionen zu erzeugen. Die Biogenese von miRNA ist ähnlich wie bei anderen RNAs, die aus der DNA-Transkription hervorgehen. Eine primäre miRNA ist ein unabhängiges Transkript, das von der RNA-Polymerase II prozessiert wird, und sie wird im Zellkern durch den „Mikroprozessor“-Komplex gebunden, der aus Ribonuklease III (einer Mg2+-abhängigen Endonuklease), Drosha und seinem Co-Faktor Pasha (DGCR8) besteht. Die Erzeugung reifer miRNAs aus Vorläufer-miRNAs durch den Ribonuklease III (Dicer1 /TRBP-Komplex im Zytoplasma . Dicer ist eine spezialisierte Ribonuklease, die die RNA-Interferenz einleitet, indem sie doppelsträngige RNA in miRNA-Fragmente spaltet, und TRBP (das Transaktivierungsprotein des Humanen Immundefizienzvirus, das auf doppelsträngige RNA reagiert) ist ein integraler Bestandteil eines Dicer-enthaltenden Komplexes.

Neoplasie, die viele Krankheiten einschließt, ist eine Anomalie der zellulären Differenzierung, Reifung und Kontrolle des Wachstums. Rupert Allan Willis (1898-1980) definierte Neoplasma als „eine abnorme Gewebemasse, deren Wachstum das des umgebenden normalen Gewebes übersteigt und nicht mit diesem koordiniert ist und die nach dem Wegfall der Reize, die die Veränderung hervorgerufen haben, in der gleichen übermäßigen Weise fortbesteht“, und diese Definition ist die am häufigsten zitierte. Außerdem wurde gezeigt, dass verschiedene neoplastische und nicht-neoplastische Krankheiten zirkulierende Nukleinsäuren enthalten und dass diese bei Krebs meist aus dem Tumor stammen. Daher wird die Menge der zirkulierenden Nukleinsäuren, die mit der Tumorlast und dem Fortschreiten des Tumors in Verbindung gebracht werden, für die Krebsvorsorge, die Prognose und die Überwachung der Wirksamkeit einer Krebstherapie verwendet.

Auch Conrad H. Waddington (1905-1975) hatte über ein kompliziertes Zusammenspiel zwischen der zellulären Umgebung und den Auswirkungen der Gene auf die Bestimmung des Phänotyps berichtet; er schrieb die molekularen Signale epigenetischen Phänomenen zu. Die epigenetischen Signale, die für die Etablierung, Aufrechterhaltung und Umkehrung metastabiler Transkriptionszustände verantwortlich sind, stehen in direktem Zusammenhang mit Promotor-Hypermethylierung und zum Schweigen gebrachten Tumorsuppressorgenen, vorgeschalteten Transkriptionsfaktoren und DNA-Reparaturenzymen. Da Krebs letztlich eine Krankheit der Gene ist, bleibt der Mechanismus, durch den epigenetische Informationen durch die Zellteilung übertragen werden, unklar, da die komplexen epigenetischen Zustände durch mehrere konvergierende Signale orchestriert werden .

Die biologisch aktiven RNAs, darunter mRNA, tRNA, rRNA, kleine Nuklein-RNAs und andere nichtcodierende RNAs, enthalten selbstkomplementäre Sequenzen, die es Teilen der RNA ermöglichen, sich zu falten und mit sich selbst zu paaren, um Doppelhelixen zu bilden (Abbildung 2).

Abbildung 2

Der grundlegende Prozess der Informationsübertragung in Zellen.

Die Analyse dieser RNAs hat gezeigt, dass sie stark strukturiert sind und nicht aus langen Doppelhelixen bestehen, sondern aus Ansammlungen kurzer Helices, die zu Strukturen zusammengefügt sind, die Proteinen ähneln. RNAs falten sich und passen sich der chemischen Katalyse von Enzymen an, so besteht beispielsweise die aktive Stelle des Ribosoms, die die Bildung und Freisetzung von Peptidbindungen analysiert, vollständig aus RNA. Die rRNA ist als strukturelle Komponente der Ribosomen notwendig, auf denen die eigentliche Übersetzung stattfindet, und die tRNA ist für die Aktivierung der Aminosäuren, als Adaptor bei der mRNA-gesteuerten Aminosäurespezifikation und für die Bindung der wachsenden Proteinketten an die Ribosomen erforderlich (Abbildung 2). Bei der DNA-Transkription wird die Positionierung der Nukleotideinheiten in den entstehenden RNA-Molekülen von der DNA kontrolliert, die als Vorlage dient. Die Art und Weise, wie diese Vorlage eine solche Sequenz vorgibt, beinhaltet sowohl Wechselwirkungen zwischen Basenpaarungen als auch spezifische Wechselwirkungen zwischen Proteinen und Nukleinsäuren. Jede RNA-Kette wird an einer bestimmten Stelle der DNA-Vorlage eingeleitet und an einer anderen, einzigartigen Stelle der Vorlage beendet, d. h. es gibt definierte Transkriptionseinheiten. Es handelt sich um einen selektiven Prozess. Der Transkriptionsapparat erkennt spezifische Signale auf der DNA-Vorlage. Die Initiation wird durch Promotorregionen in der DNA gesteuert, und die Region, die die Terminierung steuert, wird als Terminator bezeichnet.

(1) Transkription: Die in der Nukleotidsequenz der DNA kodierte Information wird durch die Synthese von mRNA transkribiert, deren Sequenz durch die DNA-Sequenz vorgegeben ist. (2) Translation: Die Sequenz der mRNA wird von der Proteinsynthesemaschinerie entschlüsselt und in die Sequenz der Aminosäuren eines Proteins übersetzt. Dieser Informationstransfer ist in dem Dogma verankert: DNA → RNA → Protein.

Übernommen aus: Hernández, G. (2012) On the Emergence and Evolution of the Eukaryotic Translation Apparatus, in Cell-Free Protein Synthesis, Biyani, M. (ed.), S.32. Abgerufen am 13. September 2014 von http://cdn.intechopen.com/pdfs-wm/39965.pdf.

Archibald Garrod (1857-1936) war einer der ersten Wissenschaftler, der vorschlug, dass vererbte Faktoren (Gene) die Funktion von Proteinen kontrollieren. Defekte (Krankheiten) im Stoffwechsel könnten darauf zurückzuführen sein, dass bestimmte Enzyme wesentliche biochemische Reaktionen nicht katalysieren. Die Proteinsynthese, die Translation, wird durch ein mRNA-Molekül gesteuert. Die Übersetzung erfolgt in zwei Phasen: (1) Informationsübertragung, bei der die RNA-Basensequenz der mRNA die Reihenfolge der Aminosäuren bestimmt, und (2) chemische Prozesse, bei denen die Peptidbindungen zwischen den benachbarten Aminosäuren gebildet werden. Zu den für die Translation erforderlichen Komponenten gehören: mRNA, Ribosomen (60S und 40S), tRNA, Aminoacyl-tRNA-Synthetasen und akzessorische Proteine, die an der Initiation, Elongation und Terminierung beteiligt sind. Bei der Dehnung können drei Prozesse unterschieden werden: (1) Ausrichtung jeder aminoacylierten tRNA, (2) Bildung der Peptidbindung, um die neue Aminosäure an die Polypeptidkette anzufügen, und (3) Bewegung des Ribosoms entlang der mRNA um drei weitere Basen (ein Codon). Die Verlängerung geht weiter, bis ein Stoppcodon erreicht wird. Im genetischen Code gibt es drei Stoppcodons: UAG, UGA, UAA.

Es ist außerordentlich schwierig, die krebserregende Wirkung so vieler landwirtschaftlicher, industrieller und Haushaltschemikalien zu beurteilen, aber eine erhebliche Gefahr geht von der Entsorgung verschiedener landwirtschaftlicher und industrieller Abfälle aus, die das Trinkwasser, die Küstengewässer und die Meeresumwelt verschmutzen können. Auch die Identifizierung eines chemischen Karzinogens ist problematisch, da zwischen der chemischen Exposition und der Entstehung von Krebs eine lange Zeitspanne liegt, es sei denn, die Wirkung ist dramatisch. In Anbetracht der großen Zahl chemischer Stoffe, denen die Menschen im Laufe ihres Lebens ausgesetzt sind, zeigt Tabelle 1 die am stärksten nachgewiesenen krebserregenden Chemikalien.

Tabelle 1 Wichtige chemische Karzinogene beim Menschen

Virus ist ein ultramikroskopisches Virion, das von einer schützenden Proteinhülle umhüllt ist, ein infektiöses Agens, ein obligater intrazellulärer Parasit, dessen Replikation von seinem DNA- oder RNA-Kern und dem Protein-Syntheseprozess der Wirtszelle für das Wachstum in der Gewebekultur abhängt. Die wichtigsten pathogenen Viren sind Adenoviridae, Flaviviridae, Hepadnaviridae, Herpesviridae, Homyxoviridae, Papovaviridae, Paramyxoviridae, Picornaviridae, Polyomaviridae, Orthomyxoviridae, Rhabdoviridae und Togaviridae. Die Virusinfektion erreicht in der Regel den optimalen Zeitpunkt für die Replikation, wenn klinische Symptome auftreten, und die Replikation besteht aus folgenden Schritten: (1) Anheftung an und Eindringen in die empfängliche Zelle, (2) Abbau von Nichtstrukturproteinen, um Nukleinsäure für die Virusvermehrung verfügbar zu machen, (3) Synthese von RNA oder DNA durch Transkription und Translation (Abbildung 2), (4) Synthese von Struktur- und Funktionsproteinen und (5) Zusammenbau und Freisetzung reifer Viruspartikel aus der Zelle . Tabelle 2 zeigt antivirale chemische Wirkstoffe, die klinisch die Virusreplikation blockieren würden, wenn sie bei Ausbruch der Krankheit verabreicht werden, d. h. Chemoprophylaxe.

Tabelle 2 Antivirale Wirkstoffe und einige ihrer Eigenschaften

Methodologie

Bei der Infektion durchdringt die virale RNA die Membranen der menschlichen Wirtszellen, woraufhin sie entweder durch verschiedene zelluläre RNasen zerstört wird oder sich an Ribosomen bindet und wächst und sich teilt, um in einem unregulierten, beschleunigten Tempo Proteine zu bilden. Der Prozess des Transkriptionszyklus, der aus Präinitiation, Initiation, Promotorfreigabe, Elongation und Terminierung besteht, hat einen erheblichen Einfluss auf das Wachstumspotenzial von Tumoren. Die Tatsache, dass die Wirtszelle die Virusinfektion nicht erkennt und zerstört, ist auf das Fehlen bestimmter co-stimulierter Moleküle zurückzuführen, die die Reaktion von Antigenen mit Lymphozyten unterstützen. Die Grundlagenforschung auf dem Gebiet des Krebses umfasst daher die Ermittlung der Ursachen und die Entwicklung von Strategien zur Prävention, Diagnose, Behandlung und Heilung. Die Forschung erstreckt sich auf Chemotherapie, Hormontherapie, Immuntherapie, Nanomaterialien, palliative Chirurgie, Strahlentherapie und kombinierte Behandlungsmodalitäten; die Bewertungsmethoden waren hauptsächlich (1) zytologische Methoden (Exfoliativ- und Aspirationszytologie), (2) Durchflusszytometrie, (3) hystologische Methoden, (4) Immunhistochemie, (5) molekulare Diagnose (Aptamere), (6) Tumormarker (Hormone (Calcitonin, Katecholamin & Metaboliten, ektopisches, humanes chronisches Gonadotropin-HCG), onkofetale Antigene (α-fetales Protein, carcino-embryonales Antigen), Isoenzyme, spezifische Proteine, Mucine und Glykoproteine, neue molekulare Marker).

RNA-Phagen jedes Schrittes der Proteinsynthese, der kontrolliert werden könnte, ist ein Hinweis auf die individuelle, miteinander verbundene Biosynthese eines bestimmten Proteins . Die Geschwindigkeit der Initiationskomplexbildung diktiert die Menge jedes der viralen Proteine. Die RNA-Polymerasen beginnen mit der Replikation der viralen RNA, ein Prozess, der zu den zentralsten Vermittlern der malignen Transformation gehört. RNA-Polymerase I , RNA-Polymerase II und RNA-Polymerase III transkribieren proteinkodierende Gene und interagieren mit Faktoren, die an der Synthese der rRNA-Vorläufer 45S, dem Chromatin-Umbau, der Transkriptionsaktivierung, der Elongation und der RNA-Verarbeitung beteiligt sind.

Die multizellulären eukaryotischen menschlichen Enzyme können unter Verwendung isolierter Organellen, wie Kern, Nukleoli, Mitochondrien und anderer interner Organellen als Ausgangsmaterial gereinigt werden, obwohl die gleichzeitige Gewinnung aller drei RNA-Polymerasen aufgrund der Diffusionsfähigkeit einiger Kernenzyme nicht immer möglich ist. Jacob und Rose hatten die Methoden der Solubilisierung, Reinigung und Schwierigkeiten von Säugetier-RNA-Polymerasen ausführlich untersucht.

HeLa-Zellen waren oft die Quelle für RNA-Polymerase-Komplexe; mitotische Zellen und Krebsgewebe mit entsprechenden normalen Geweben, die gesammelt und in flüssigem Stickstoff bei -80°C eingefroren werden können, sind bis zum Versuch lebensfähig. Die histopathologische Untersuchung erfolgt an den mit 10% Formalin fixierten, in Paraffin eingebetteten Gewebeproben, die eine unschätzbare Ressource für die klinische Forschung darstellen, obwohl die extrahierten Nukleinsäuren fragmentiert und chemisch modifiziert sind, was ihre Verwendung in molekularen Studien erschwert. Histopathologische Beobachtungen werden zur Bestimmung des Krankheitsverlaufs, der Anfälligkeit für Metastasen, der Empfindlichkeit für Therapie und Strahlentherapie sowie der Prognose herangezogen. Interessanterweise ermöglicht die nicht-invasive Technik der Raman-Spektroskopie die Beobachtung intrazellulärer biologischer Moleküle ohne Fixierung oder Markierungsverfahren in situ.

Der Bicinchoninsäure-Kit-Proteinquantifizierungstest, der weithin zur Bestimmung von Proteinkonzentrationen im Bereich 25-2000 μg/ml verwendet wird. Die Zellen werden suspendiert und in hypotonischem Puffer (20 mM Tris-HCl , 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM ZnCl2 mit 1% Triton X-100) für 5 min auf Eis lysiert; sie wurden dann durch zonale Zentrifugation in Saccharose bei 15.000 rpm für 15 min bei 4°C in nukleolare und nukleoplasmatische Fraktionen getrennt, und der Überstand wurde gesammelt und bis zur Wiederverwendung bei -20°C eingefroren. Bei dieser Methode handelt es sich um eine modifizierte Form der Lowry et al.- und Bradford-Methode, die ebenfalls weit verbreitete farbstoffbindende chromogene Proteinvariationstests sind. Der Bradford-Protein-Assay basiert auf der Assoziation spezifischer Aminosäurereste, Arginin, Lysin und Histidin, mit nicht konjugierten Gruppen des Farbstoffs Coomassie Brillantblau G-250 in einer sauren Umgebung. Wenn sich der Farbstoff-Protein-Komplex bildet, wandelt sich der pKa-Wert der rot-braunen sauren Lösung in blau um und wird bei 595 nm gemessen. Der Bradford-Farbstoff ist ein bequemes, schnelles und relativ empfindliches Protokoll, aber verschiedene Verbindungen können den Test gegenüber typischen Standardkurven für Rinderserumalbumin und Rindergamaglobulin stören. Die andere Lowry et al. Protein-Assay liegt in der Bildung von Peptid-Stickstoff (s) Komplex mit Cu2 + unter alkalischen Bedingungen (pH 10,0-10,5), und die anschließende Reduktion des Folin-Ciocalteay Phosphomolybdän-Phosphorwolframsäure-Reagenz zu Heteropolymolybdänblau bei Spektren 750 nm, obwohl Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) kann mit Chromophor Produktion stören .

Die Radioimmunhistochemie ist ein sehr empfindliches In-vitro-Verfahren, bei dem ein rückverfolgbares radioaktives Isotop einen Marker zum Nachweis, zur Identifizierung und zur Quantifizierung der Konzentration einer oder mehrerer spezifischer ochemischer Neoplasiesubstanzen markiert. Der Radioimmunoassay wurde entwickelt, um die Konzentration von RNA-Polymerase I, RNA-Polymerase II, RNA-Polymerase III und mRNA zu identifizieren und zu quantifizieren. Er ist zwar weniger empfindlich als die enzymatische Aktivität als Maß für die reverse Transkriptase, aber er kann Antigene mit winzigen Proteinmengen und in Gegenwart von Inhibitoren für ein RNA-Tumorvirus produzierende Zellen nachweisen.

Die drei RNA-Polymerasen transkribieren das Genom in den Zellkernen. Am wichtigsten ist die RNA-Polymerase II, die für die Synthese von mRNA und einer Vielzahl von nichtcodierenden RNAs verantwortlich ist; die RNA-Produktion in wachsenden Zellen erfolgt durch die RNA-Polymerase I, die den Vorläufer der großen rRNA transkribiert, und durch die RNA-Polymerase III, die rRNA, tRNA und einige nichtcodierende RNAs transkribiert. Hossenlopp et al. haben Anti-Polymerase I-Serum verwendet, um die drei RNA-Polymerasen in der Reihenfolge ihrer Hemmung zu klassifizieren: I > III > I, was darauf hindeutet, dass die Polymerasen I und II enger miteinander verwandt sind als die Polymerasen I und II.

Feststellungen und Interpretationen

Die unterschiedliche Wirkung der selektiven Hemmung auf die nukleäre und nukleoplasmatische RNA-Synthese hängt mit der Existenz unterschiedlicher nukleärer und chromosomaler RNA-Polymerasen zusammen, die mitotische-ähnliche biochemische und morphologische Reaktionen hervorrufen. Auch die Ribosomensynthese in HeLa-Zellen wird nachweislich auf der Ebene der Verarbeitung und nicht auf der Ebene der 45S-RNA-Transkription gesteuert, wo chemische Wirkstoffe die physiologischen und strukturellen Übergänge der viralen Mitose verursachen würden. In Tabelle 2 sind einige dieser therapeutischen Wirkstoffe aufgeführt, die den Prozess der Virusreplikation stören können.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Aufkommen der Sequenzierung des menschlichen Genoms beeindruckende Fortschritte bei der Diagnose, Prognose und den Behandlungsmethoden für invasive menschliche Tumorzellen ermöglicht hat. Ein neues Forschungsgebiet sind chemische Wirkstoffe, die in den mitosebedingten Zelltod (Apoptose) eingreifen, chemotherapieresistente neoplastische Zellen denaturieren und die Proteinexpression hemmen können. Giri und Kumar haben berichtet, dass die übermäßige Expression von Neo-Poly(A)-Polymerase in menschlichen Krebszellen auf die Bedeutung der Polyadenylierung im zellulären Geschehen bei Krebs hinweist. Es hat sich gezeigt, dass die Spezifität einer elektrostatischen Wechselwirkung zwischen RNA und natürlichen Alkaloiden oder ihren synthetischen Analoga in der Lage ist, eine Selbststrukturierung der Polyadenelation zu bewirken. Daher können neue, neuartige Verbindungen, die eine ausgezeichnete Bindungsaffinität zu vielen RNA-Strukturen aufweisen, zur Modulation der Poly(A)-Struktur bei der Entwicklung von auf RNA ausgerichteten Krebstherapeutika eingesetzt werden. Nanopartikel aus Aptameren werden ebenfalls entwickelt, um die Reaktion spezifischer Antigenepitope mit ihren Bindungsstellen zu steuern. Dies sind vielversprechende Techniken für die klinische Diagnose und Therapie. Diese neuen Erkenntnisse über die Genetik von Tumoren haben zu bahnbrechenden Einsichten in die Entwicklung neuer Medikamente geführt, mit denen sich bestimmte Tumoren behandeln, schrumpfen und in eine verlängerte Remission überreden lassen.

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