Biosyntéza ribonukleové kyseliny (RNA) u rakoviny člověka

Rudolf Virchow (1821-1902) je obecně považován za prvního, kdo rozpoznal leukemické buňky, a Fridrich Miescher (1844-1895) identifikoval a izoloval buněčné látky obsahující dusík a fosfor, zatímco Albrecht Kossel (1853-1927) izoloval nukleové kyseliny: (adenin a guanin) a tři pyrimidiny (tymin, cytosin a uracil). Rakovina je však definována jako skupina více než 100 různých onemocnění, která je způsobena mnohočetnými změnami v buněčné DNA a RNA a je charakterizována nekontrolovatelným růstem (mitózou), při němž jsou buňky agresivní, invazivní a někdy metastazují . Také objev dvojité šroubovice molekuly DNA Watsonem a Crickem byl dalším milníkem ve vědě dvacátého století (obr. 1). Genetický materiál živých organismů a dvojitá šroubovice molekuly DNA vytvořily základ nové disciplíny molekulární biologie.

Obrázek 1

Základní jednovláknová RNA a dvouvláknová DNA nukleové kyseliny.

Plný závit dvoušroubovice DNA se rozprostírá na deseti párech bází, které pokrývají vzdálenost 34 Ǻ (3,4 nm). Jednotlivé páry bází jsou od sebe vzdáleny 34 Ǻ (3,4 nm). V místech, kde se vlákna kříží, se skrývají páry bází, které se táhnou kolmo k pozorovateli. Vnitřní průměr je 11 Ǻ (1,1 nm) a vnější průměr 20 Ǻ (2,0 nm). Uvnitř válcovitého obrysu dvojité šroubovice jsou dvě drážky, které jsou dostatečně velké, aby se v nich mohly nacházet polypeptidové řetězce. Největší lidský chromozom, chromozom číslo 1, se skládá z přibližně 220 milionů párů bází a je dlouhý 85 nm. Znaménka minus podél vláken dvojité šroubovice představují mnoho záporně nabitých fosfátových skupin po celé délce každého vlákna. Na rozdíl od dvouvláknové DNA je RNA v mnoha svých biologických úlohách jednovláknovou molekulou a má mnohem kratší řetězec nukleotidů. RNA však může komplementárním párováním bází vytvářet vnitrovláknové dvoušroubovice, jako je tomu u tRNA. Zatímco DNA obsahuje deoxyribózu, RNA obsahuje ribózu (u deoxyribózy není k pentózovému kruhu v poloze 2′ připojena hydroxylová skupina). Díky těmto hydroxylovým skupinám je RNA méně stabilní než DNA, protože je náchylnější k hydrolýze. Komplementární bází k adeninu není thymin jako v DNA, ale uracil, což je nemetylovaná forma thyminu.

Převzato z: Watson J.D. and Crick, F.H.C. (1953) „Molecular structure of nucleic acid. A structure of deoxyribosenucleic acid“, Nature, vol.171, pp.737-738; Gregory, S., Barlow, K.F., McLay, K.E., Kaul, R., Swarbreck, D., Dunham, A., Scott, C.E., Howe, K.L. and Woodfine, K. (2006). „Sekvence DNA a biologická anotace lidského chromozomu 1“. Nature, vol. 441 (7091), pp.315-221; Nelson, D.L. and Cox, M.M. (2008) Lehninger Principles of Biochemistry, 5th edn, pp.277-287. (česky). New York, NY: W.H. Freeman and Company.

Detailní mechanismus, jakým se takový genetický materiál mohl projevit jako strukturní a katalytické proteiny, které hrají tak důležitou roli ve fungování všech živých buněk, stále nebyl zřejmý. Stanley miller (1930-2007) a Harold Urey (1893-1981) navrhli experiment, který simuloval hypotetické podmínky, o nichž se předpokládalo, že byly přítomny v době raného života na Zemi, a kvalitativně testoval výskyt pozemských chemických látek, které daly vzniknout životu . Základní chemické prvky H2, CH4, H2O a NH3, které byly uzavřeny ve sterilních skleněných baňkách a zkumavkách, byly vystaveny elektrickým výbojům a jejich interakcí vzniklo 20 aminokyselin, stavebních prvků bílkovin, a další organické sloučeniny jako: adenosintrifosfát, lipidy, některé cukry a báze pro RNA a DNA (Lazcano a Bada ).

Crick a spol. navrhli elegantní experimentální strategii pro určení povahy genetického kódu, která byla pozoruhodně správná, přestože neexistovala technologie pro analýzu a porovnání sekvence DNA a bílkovin. Genetický kód je vztah mezi sekvencí bází v DNA (nebo jejích transkriptech RNA) a sekvencí aminokyselin v bílkovinách . Vlastnosti genetického kódu jsou následující: (1) tři nukleotidy kódují aminokyselinu, (2) kód se nepřekrývá, (3) kód nemá interpunkci a (4) genetický kód je degenerovaný .

Prolin se od této základní struktury liší pouze tím, že obsahuje neobvyklý kruh na N-konci aminoskupiny, který nutí amidovou část CO-NH do pevné konformace . Jakmile byl učiněn tento koncepční průlom, mohl v laboratoři začít složitý úkol odhalování mnoha kroků biosyntézy bílkovin . Sekvence aminokyselin v bílkovině je definována genem a zakódována v genetickém kódu. Ačkoli tento genetický kód specifikuje 20 různých L-α-aminokyselin, zbytky v proteinu jsou často chemicky pozměněny v rámci posttranslační modifikace: buď předtím, než protein může fungovat v buňce, nebo jako součást kontrolních mechanismů .

Geny jsou tvořeny nukleovými kyselinami, které obsahují instrukce pro tvorbu proteinů; enzymy jsou také tvořeny proteiny a jsou potřebné k replikaci genů .

Genetická informace zakódovaná ve dvou komplementárních vláknech DNA jakéhokoli strukturního genu je přepisována enzymem zvaným DNA-dependentní RNA polymeráza, který katalyzuje syntézu RNA z DNA nebo RNA předlohy . Eukaryotické RNA polymerázy (pol-I , pol-II a pol-III jsou ústřední multiproteinové stroje. DNA-dependentní RNA polymeráza vytváří jednovláknovou kopii RNA, komplementární k jednomu z vláken, která se nazývají mRNA. Ta se připojuje k subcelulární organelle ribozomu, který se skládá ze dvou podjednotek o průměru 25 až 30 nm (250-300 Å) s poměrem rRNA k roteinu, který se blíží 1 . Funguje jako černá skříňka, na níž se překládá mRNA . Pojem translace zahrnuje všechny kroky, kterými se genetický obsah mRNA obsažený v lineární sekvenci ribonukleotidů převádí na lineární sekvenci aminokyselin . Zatímco mRNA lze považovat za prostředek, kterým je genetická informace skutečně přenášena z genomu (DNA) a umístěna do příslušných cytoplazmatických míst pro translaci do bílkovin . Biogeneze a údržba organel vyžaduje nově syntetizované proteiny, z nichž každý musí projít od ribozomu překládajícího jeho mRNA ke správné translokaci do podkompartmentu organely . Zajímavé je, že bylo prokázáno, že s tukem a obezitou spojený gen se nachází na chromozomu 16 mRNA demetylázy , tj. metylace mRNA hraje kritickou roli v energetické homeostáze člověka .

Nukleové kyseliny jsou sestaveny z jednotlivých nukleotidů stejně jako proteiny jsou sestaveny z jednotlivých aminokyselin. Nukleotidy jsou syntetizovány řadou reakcí zprostředkovaných enzymy . Biochemickými cestami se odděleně sledují syntézy ribózy a různých bází, které se pak sestavují za vzniku nukleotidových trifosfátů . Molekula přenášející energii ATP, která se skládá z báze adeninu, ribózy a tří fosfátových skupin, je také jedním ze stavebních kamenů nukleotidů používaných při syntéze RNA a dalšími jsou guanosintrifosfát, cytidintrifosfát a uridintrifosfát . Tyto nukleotidy se obvykle syntetizují přenosem energie z ATP na jejich difosfátové formy nukleotidů . Existuje tedy obecná zásoba nukleotidtrifosfátů, které v buňce fungují jako stavební kameny pro RNA . Tyto volné nukleotidy se sestavují do lineární sekvence, kdy molekula RNA obsahuje část kódované informace, která je přítomna v DNA, a při kopírování DNA do mRNA pomocí párování bází adenin-thymin a guanin-cytosin probíhá proces transkripce DNA . Během syntézy mRNA se vazby mezi těmito páry v DNA, adenin-thyminem a guanin-cytosinem, a dvouvláknovou strukturou částečně rozpletou a obě vlákna se oddělí . Báze volných nukleotidových trifosfátů a báze v jednom z oddělených řetězců DNA vytvářejí nové vazby. DNA tedy funguje jako šablona, která velí sekvenci bází v RNA. Báze adenin ve volném nukleotidu by se párovala s bází thymin v DNA a báze uracil ve volném nukleotidu by se rovněž párovala s bází adenin v DNA. Podobně se báze cytosin ve volném nukleotidu páruje s bází guanin v DNA a báze guanin ve volném nukleotidu se páruje s bází cytosin v DNA . Výsledkem by byla nová sekvence bází v RNA, která je enantiomerním zrcadlovým obrazem sekvence bází v DNA . Protože hlavní výhodou párování nukleotidových bází je, že se dvě vlákna DNA mohou snadno a přesně replikovat, může se každá báze párovat pouze s jednou další bází (thymin s adeninem, adenin s thyminem, cytosin s guaninem a guanin s cytosinem). Pokud tedy původní kodon DNA obsahuje sekvenci bází cytosin-guanin-thymin, komplementární sekvence kodonu v mRNA je guanin-cytosin-adenin .

Po spárování příslušných volných nukleotidtrifosfátů s odpovídajícími bázemi v DNA jsou nukleotidy vzájemně spojeny enzymem RNA-polymerasa II (12 podjednotek), který způsobuje odštěpení pyrofosfátu z nukleotidtrifosfátu v procesu spojování jednoho nukleotidu s druhým, čímž vzniká cukr-fosfátová páteř mRNA . Tento enzym je aktivní pouze v přítomnosti DNA a v její nepřítomnosti volné nukleotidtrifosfáty nespojuje . Enzym se pohybuje podél vlákna DNA a spojuje jeden nukleotid po druhém do rostoucího řetězce mRNA . Aktivita RNA-polymerázy II je závislá na DNA, což znamená, že předtím, než může syntetizovat transkript RNA, musí mít k dispozici templátovou molekulu DNA. DNA-dependentní polymeráza musí mít k dispozici také Mg2+ a ribonukleosid 5′ trifosfáty, aby mohla provádět syntézu RNA. RNA polymeráza vytváří nové vlákno RNA od 5′ do 3′ .

Exprese proteinů je určena rychlostí transkripce a posttranskripčními procesy, které vedou ke změnám v transportu mRNA, stabilitě a účinnosti translace . Tyto posttranskripční procesy jsou zprostředkovány modifikacemi RNA, sekundární strukturou, mikro RNA (miRNA) a proteiny vázajícími RNA, které rozpoznávají regulační prvky umístěné v 3′ nepřekládaných oblastech transkriptů . Kritický buněčný proces polyadenylace, což je přidání poly(A) ocásku k mRNA, který hraje důležitou roli v mnoha aspektech buněčného metabolismu mRNA, ačkoli začíná ve chvíli, kdy přepis genu končí nebo je ukončen. Nejdůležitější 3′ segment nově vytvořené pre-MRNA je nejprve odštěpen souborem proteinů; tyto proteiny pak syntetizují poly(A) ocas na jednom z několika možných míst . Štěpením vzniká volná 3′-hydroxylová skupina, která určuje konec mRNA, k níž jsou ihned přidány adeninové zbytky polyadenylátpolymerázou, která katalyzuje reakci:

$$ \mathrm{R}\mathrm{N}\mathrm{A} + \mathrm{nATP} \circ ledR\ \mathrm{R}\mathrm{N}\mathrm{A}\hbox{-} {\left(\mathrm{A}\mathrm{M}\mathrm{P}\right)}_{\mathrm{n}} + {\mathrm{n}\mathrm{P}\mathrm{P}}_{\mathrm{i}} $$

kde n = 200-250 . Poly(A) ocásek a s ním spojené proteiny s větší pravděpodobností chrání mRNA před enzymovou destrukcí . Geny kódující proteiny mohou mít více než jedno polyadenylační místo, „extra RNA“, takže gen může kódovat několik mRNA, které se liší svým 3′ koncem , ačkoli polyadenylace mRNA je řízena různými cis-aktanty obklopujícími místo štěpení a jejich vazebnými faktory. Protože alternativní polyadenylace mění délku 3′ nepřekládané oblasti, je globální zkrácení 3′ nepřekládaných oblastí prostřednictvím alternativní polyadenylace novým charakteristickým znakem rakoviny ; může také změnit, která vazebná místa pro miRNA 3′ nepřekládaná oblast obsahuje . Poliadenylace je tedy způsob, jak označit RNA k degradaci pro mnoho nekódujících RNA, včetně tRNA, rRNA,snRNA a snoRNA . Exosom RNA (30-100 nm) je konzervovaný degradační stroj, který získává plnou aktivitu pouze ve spojení s kofaktory; poly(A) ocasy byly nalezeny na fragmentech lidské RNA jak homopolymerních, tak většinou heteropolymerních ocasů . Regulovaná polyadenylace specifických mRNA se podílí na oogenezi, progresi buněčného cyklu a synaptické plasticitě . Stále častěji se zjišťuje, že mnoho polyadenylačních trans-akčních faktorů, včetně polyadenylátové polymerázy, se podílí na buněčném cyklu, apoptóze a prognóze rakoviny . Geny podléhající alternativnímu štěpení a polyadenylaci během progrese lidské rakoviny tak mohou být užitečnými novými biomarkery a potenciálně cílenými pro prevenci a léčbu onemocnění .

Mikro RNA jsou endogenní třídou posttranskripčních regulátorů, které regulují až třetinu lidských genů; jsou malé délky (21-25 nukleotidů dlouhé fragmenty) a jednovláknové . Studie naznačují, že přibližně polovina známých mikroRNA se nachází v RNA nekódující proteiny (intron a extron) nebo v intronu genů kódujících proteiny . Mohou rozpoznávat a vázat se na nedokonalé komplementární sekvence párování bází v 3′ nepřekládané oblasti více cílových mRNA, blokovat translaci genové exprese nebo vyvolat štěpení mRNA a řídit tak množství kritických procesů buď snížením, nebo inhibicí translační účinnosti cílové mRNA . Nedávné studie ukázaly, že miRNA jsou aberantně exprimovány u různých lidských onemocnění, od rakoviny po kardiovaskulární hypertrofii . Mikro RNA cílí na ~ 60 % všech genů a jsou hojně přítomny k potlačení 100 s cílů ve všech lidských buňkách; bioinformatika uvádí, že 22 nukleotidová jednovláknová RNA složená ze 4 různých ribonukleotidů, může mít více než 1013 možných kombinací sekvencí. Protože tedy buňka obsahuje typicky ~1049 miRNA, musí existovat velmi vysoký vývojový a evoluční selekční tlak, který využívá pouze specifické sekvence oligonukleotidů miRNA k získání biologicky užitečných interakcí miRNA-mRNA . Biogeneze miRNA probíhá podobně jako u jiných RNA počínaje transkripcí DNA. Primární miRNA je nezávislý transkript zpracovávaný RNA polymerázou II a v jádře jsou vázány „mikroprocesorovým“ komplexem, který se skládá z ribonukleázy III (Mg2+ závislá endonukleáza), Drosha a jejího kofaktoru Pasha (DGCR8) . Tvorba zralých miRNA z prekurzorů miRNA pomocí komplexu ribonukleázy III (Dicer1 /TRBP v cytoplazmě . Dicer je specializovaná ribonukleáza, která iniciuje RNA interferenci štěpením dvouřetězcové RNA na fragmenty miRNA , a TRBP (transaktivační reakce viru lidské imunodeficience na dvouřetězcovou RNA-vázaný protein) je nedílnou součástí komplexu obsahujícího Dicer .

Neoplazie, která zahrnuje mnoho nemocí, je porucha buněčné diferenciace, zrání a kontroly růstu . Rupert Allan Willis (1898-1980) definoval novotvar jako „abnormální masu tkáně, jejíž růst převyšuje růst okolních normálních tkání a není s ním koordinován a přetrvává stejně nadměrně i po ukončení podnětů, které změnu vyvolaly“, a tato definice je široce citovaná . Také u několika nádorových i nenádorových onemocnění bylo prokázáno, že obsahují cirkulující nukleové kyseliny a že u rakoviny pocházejí převážně z nádoru . Proto se hladina cirkulujících nukleových kyselin, které byly spojeny s nádorovou zátěží a maligní progresí, využívá pro screening rakoviny, prognózu a sledování účinnosti protinádorové léčby .

Také Conrad H. Waddington (1905-1975) popsal složitou souhru mezi buněčným prostředím a účinky genů na určení fenotypu; molekulární signály přisoudil epigenetickému jevu . Epigenetické signály, které jsou zodpovědné za ustavení, udržení a zvrácení metastabilních transkripčních stavů, mají přímou souvislost s hypermetylací promotorů a umlčenými tumor supresorovými geny, transkripčními faktory v horním proudu a enzymy opravujícími DNA . Vzhledem k tomu, že rakovina je v konečném důsledku onemocněním genů, zůstává mechanismus, jakým se epigenetická informace přenáší při dělení buněk, nejasný, protože komplexní epigenetické stavy jsou organizovány několika sbíhajícími se signály .

Biologicky aktivní RNA, včetně mRNA, tRNA, rRNA, malých nukleových RNA a dalších nekódujících RNA , obsahují samokomplementární sekvence, které umožňují, aby se části RNA skládaly a párovaly samy se sebou a vytvářely dvojité šroubovice (obrázek 2).

Obrázek 2

Základní proces přenosu informace v buňkách.

Analýza těchto RNA odhalila, že jsou vysoce strukturované a netvoří je dlouhé dvojité šroubovice, ale spíše soubory krátkých šroubovic zabalených do struktur podobných proteinům. RNA se skládají a přizpůsobují chemické katalýze enzymů , například aktivní místo ribosomu, které analyzuje tvorbu a uvolňování peptidových vazeb, se skládá výhradně z RNA. RRNA je nezbytná jako strukturní součást ribozomů, na nichž skutečně probíhá translace, a tRNA je nutná při aktivaci aminokyselin, jako adaptér při specifikaci aminokyselin řízené mRNA a při vazbě rostoucích bílkovinných řetězců na ribozomy (obr. 2). V procesu transkripce DNA je rozmístění nukleotidových jednotek ve vytvářených molekulách RNA pod kontrolou DNA, která slouží jako templát . Prostředky, kterými tento templát diktuje takovou sekvenci, zahrnují jak interakce párování bází, tak specifické interakce mezi proteiny a nukleovými kyselinami . Každý řetězec RNA je iniciován na specifickém místě na šabloně DNA a podléhá ukončení na jiném jedinečném typu místa na šabloně, tj. existují definované jednotky transkripce . Jedná se o selektivní proces . Transkripční aparát rozpoznává specifické signály v templátu DNA. Iniciaci řídí promotorové oblasti v DNA a oblast řídící terminaci se označuje jako terminátor .

(1) Transkripce: Informace zakódovaná v nukleotidové sekvenci DNA se přepisuje syntézou mRNA, jejíž sekvence je diktována sekvencí DNA. (2) Translace: Když je sekvence mRNA dekódována strojem pro syntézu bílkovin, je přeložena do sekvence aminokyselin v bílkovině. Tento přenos informace je zapouzdřen v dogmatu:

Převzato z: Hernández, G. (2012) On the Emergence and Evolution of the Eukaryotic Translation Apparatus, in Cell-Free Protein Synthesis, Biyani, M. (ed.), str.32. Retrieved September13, 2014 from http://cdn.intechopen.com/pdfs-wm/39965.pdf.

Archibald Garrod (1857-1936) byl jedním z prvních vědců, kteří navrhli, že dědičné faktory (geny) řídí funkci proteinů . Defekty (nemoci) v metabolismu mohly být spojeny se selháním určitých enzymů při katalýze základních biochemických reakcí. Syntéza bílkovin, translace, je řízena molekulou mRNA. Lze pozorovat, že translace probíhá ve dvou fázích: (1) přenos informací, při němž sekvence bází RNA mRNA určuje sekvenci aminokyselin, a (2) chemické procesy, při nichž se vytvářejí peptidové vazby mezi sousedními aminokyselinami. Mezi složky potřebné pro translaci patří: mRNA, ribozomy (60S a 40S), tRNA, aminoacyl tRNA syntetázy a akcesorní proteiny podílející se na iniciaci, elongaci a terminaci . Lze předpokládat, že elongace zahrnuje tři procesy: (1) zarovnání každé aminoacylované tRNA, (2) vytvoření peptidové vazby pro přidání nové aminokyseliny do polypeptidového řetězce a (3) posun ribosomu podél mRNA o další tři báze (jeden kodon). Elongace probíhá až do dosažení stop kodonu. V genetickém kódu jsou tři stop kodony:

Je mimořádně obtížné posoudit karcinogenní účinky tolika zemědělských, průmyslových a domácích chemických látek, ale významné nebezpečí představuje likvidace různých zemědělských a průmyslových odpadů, které mohou kontaminovat pitnou vodu, pobřežní vody a znečištění mořského života . Identifikace chemického karcinogenu je problematická také z důvodu dlouhé prodlevy mezi expozicí chemickým látkám a vznikem rakoviny, pokud není účinek dramatický . Vzhledem k obrovskému množství chemických látek, s nimiž se lidé během svého života setkali, uvádí tabulka 1 nejsilněji prokázané karcinogenní chemické látky.

Tabulka 1 Hlavní chemické karcinogeny u lidí

Virus je ultramikroskopický virion obalený ochranným obalem z bílkovin, infekční agens, obligátní intracelulární parazit, jehož replikace závisí na jeho jádru DNA nebo RNA a procesu syntézy bílkovin hostitelské buňky pro růst v tkáňové kultuře . Hlavními patogenními viry jsou adenoviridae, flaviviridae, hepadnaviridae, herpesviridae, homyxoviridae, papovaviridae, paramyxoviridae, picornaviridae, polyomaviridae, orthomyxoviridade, rhabdoviridae a togaviridae . Virová infekce běžně dosahuje optimální doby ve funkci replikace, když se objeví klinické příznaky , a replikace se skládá z následujících kroků: (1) přichycení a proniknutí do vnímavé buňky, (2) rozložení nestrukturálních proteinů, aby byla nukleová kyselina k dispozici pro množení viru, (3) syntéza RNA nebo DNA prostřednictvím transkripce a translace (obrázek 2), (4) syntéza strukturálních a funkčních proteinů a (5) sestavení a uvolnění zralých virových částic z buňky . V tabulce 2 jsou uvedeny antivirové chemické látky, které by z klinického hlediska blokovaly replikaci viru, pokud by byly podávány na počátku onemocnění, tj. chemoprofylaxe.

Tabulka 2 Antivirové látky a některé jejich vlastnosti

Metodika

Při infekci prostupuje virová RNA membránou lidské hostitelské buňky, načež je buď zničena několika buněčnými RNázami , nebo se naváže na ribozomy a ty rostou a dělí se, aby neregulovaným zrychleným tempem vytvářely proteiny . Proces transkripčního cyklu, který se skládá z: preiniciace, iniciace,vyčištění promotoru, elongace a terminace, má významný vliv na růstový potenciál nádorů . Neschopnost hostitelské buňky rozpoznat a zničit virovou infekci je způsobena nedostatkem určitých ko-stimulovaných molekul, které napomáhají způsobu reakce antigenů s lymfocyty . Proto základní výzkum rakoviny zahrnuje identifikaci příčin a vývoj strategií prevence, diagnostiky, léčby a vyléčení . Výzkum zahrnuje chemoterapii, hormonální terapii, imunitní terapii, nanomateriály, paliativní chirurgii, radioterapii a kombinované způsoby léčby ; a metody hodnocení byly především : (1) cytologické metody (exfoliativní a aspirační cytologie), (2) průtoková cytometrie, (3) hystologické metody, (4) imunohistochemie, (5) molekulární diagnostika (aptamery), (6) nádorové markery (hormony (kalcitonin, metabolity katecholaminů &, ektopický, lidský chronický gonadotropin-HCG), onkofetální antigeny (α-fetální protein, karcinoembryonální antigen), izoenzymy, specifické proteiny, muciny a glykoproteiny, nové molekulární markery).

RNA fága každého kroku syntézy proteinu, který by bylo možné kontrolovat, svědčí o jednotlivých vzájemně souvisejících biosyntézách daného proteinu . Rychlost tvorby iniciačního komplexu diktuje množství každého z virových proteinů . RNA polymerázy začnou replikovat virovou RNA, což je proces nejvýznamnějších mediátorů maligní transformace . RNA polymeráza I , RNA polymeráza II a RNA polymeráza III přepisují geny kódující proteiny a interagují s faktory podílejícími se na syntéze prekurzoru rRNA 45S, remodelaci chromatinu, aktivaci transkripce, elongaci a zpracování RNA.

Mnohobuněčné eukaryotické lidské enzymy lze purifikovat pomocí izolovaných organel, jako je jádro, nukleoly, mitochondrie a jiné vnitřní organely jako výchozí materiál, ačkoli současné získání všech tří RNA polymeráz není vždy proveditelné kvůli difúzní povaze některých jaderných enzymů . Jacob a Rose obsáhle přezkoumali metody solubilizace, purifikace a obtíže savčích RNA polymeráz.

HeLa buňky byly často zdrojem komplexů RNA polymeráz ; mitotické buňky a nádorové tkáně s odpovídajícími normálními tkáněmi, které lze odebrat a zmrazit v tekutém dusíku při -80 °C, jsou životaschopné až do eseje . Histopatologické vyšetření se provádí na vzorcích tkání fixovaných 10% formalínem a zalitých do parafínu, což je neocenitelný zdroj pro klinický výzkum, ačkoli extrahované nukleové kyseliny jsou fragmentované a chemicky modifikované, což je činí náročnými pro použití v molekulárních studiích . Histopatologická pozorování se využívají při určování progrese, náchylnosti k metastazování, citlivosti na léčbu a radioterapii a prognózy . Zajímavé je, že neinvazivní technika Ramanovy spektroskopie umožňuje pozorování intracelulárních biologických molekul bez fixace nebo postupů značení in situ .

Kvantitativní stanovení bílkovin pomocí soupravy kyseliny bicinchoninové, která se široce používá ke stanovení koncentrace bílkovin v oblasti 25-2000 μg/ml. Buňky se suspendují a lyzují v hypotonickém pufru (20 mM Tris-HCl , 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM ZnCl2 obsahující 1% Triton X-100) po dobu 5 min na ledu; poté byly rozděleny na nukleolární a nukleoplazmatickou frakci zonální centrifugací v sacharóze při 15 000 ot/min po dobu 15 min při 4 °C a supernatant byl odebrán a zmrazen při -20 °C až do opětovného použití . Tato metoda je modifikovanou formou metod Lowryho et al. a Bradfordovy metody, které jsou rovněž široce používanými testy chromogenních variací proteinů vázaných barvivem . Bradfordův proteinový test je založen na asociaci specifických aminokyselinových zbytků, argininu, lysinu a histidinu, s nekonjugovanými skupinami barviva Coomassie brilliant blue G-250 v kyselém prostředí. Když se vytvoří komplex barvivo-protein, pKa červenohnědého kyselého roztoku se změní na modrou a měří se při 595 nm. Bradfordovo barvivo je vhodný protokol pro použití, rychlý a relativně citlivý, ale několik sloučenin může interferovat s analýzou proti typickým standardním křivkám pro hovězí sérový albumin a hovězí gama globulin. Jiný Lowryho a spol. proteinový test spočívá v tvorbě komplexu peptidového dusíku(ů) s Cu2+ za alkalických podmínek (pH 10,0-10,5) a následné redukci činidla Folin-Ciocalteayovy kyseliny fosfomolybdenové na heteropolymolybdenovou modř při spektru 750 nm, ačkoli kyselina ethylendiamintetraoctová (EDTA) může interferovat s tvorbou chromoforu .

Radioimunologická histochemie je velmi citlivá technika in vitro, při níž sledovatelný radioaktivní izotop označuje marker, který slouží k detekci, identifikaci a kvantifikaci koncentrace specifických ochemických novotvarů . Radioimunoanalýza byla vyvinuta k identifikaci a kvantifikaci koncentrace RNA polymerázy I , RNA polymerázy II , RNA polymerázy III a mRNA . Je sice méně citlivá než enzymová aktivita jako měřítko reverzní transkriptázy, ale může detekovat antigen pomocí nepatrných množství bílkovin a v přítomnosti inhibitorů pro buňky produkující RNA nádorový virus .

Tři RNA polymerázy přepisují genom v buněčných jádrech. Největší význam má RNA polymeráza II, která je zodpovědná za syntézu mRNA a velkého množství nekódujících RNA; produkci RNA v rostoucích buňkách zajišťuje RNA polymeráza I, která přepisuje prekurzor velké rRNA, a RNA polymeráza III, která přepisuje rRNA, tRNA a některé nekódující RNA . Hossenlopp a spol. použili sérum proti polymeráze I ke klasifikaci těchto tří RNA polymeráz podle pořadí jejich inhibice: I > III > I, což naznačuje, že polymerázy I a II jsou si příbuznější než polymerázy I a II .

Zjištění a interpretace

Rozdílný účinek selektivní inhibice na jadernou a nukleoplazmatickou sysntézu RNA souvisí s existencí odlišných jaderných a chromozomálních polymeráz RNA, které způsobují biochemické a morfologické reakce podobné mitotickým. Také se ukazuje, že syntéza ribozomů v buňkách HeLa je řízena spíše na úrovni zpracování než na úrovni transkripce 45S RNA, kde by chemické látky způsobovaly fyziologické a strukturální přechody virové mitózy . V tabulce 2 jsou uvedeny některé z těchto terapeutických látek, u nichž lze uvažovat o zásahu do procesu replikace viru.

Na závěr lze říci, že nástup sekvenování lidského genomu umožnil působivý pokrok v diagnostice, prognóze a metodice léčby invazivních lidských nádorových buněk. Nová oblast výzkumu chemických látek, které zasahují do buněčné smrti související s mitózou (apoptóza), jsou schopny denaturovat nádorové buňky odolné vůči chemoterapii a inhibovat expresi proteinů. Giri a Kumar uvedli, že nadměrná exprese neopoly(A) polymerázy v lidských nádorových buňkách znamená význam polyadenylace v nádorových buněčných dějích. Bylo zjištěno, že specifičnost elektrostatické interakce mezi RNA a přírodními alkaloidy nebo jejich syntetickými analogy je schopna vyvolat samostrukturu v polyadenelaci. Proto lze nové nové sloučeniny, které vykazují vynikající vazebnou afinitu k mnoha strukturám RNA, využít k modulaci struktury poly(A) při vývoji terapie rakoviny cílené na RNA . Objevují se také nanočástice aptamérů, které se zaměřují na reakci specifických epitopů antigenů s jejich vazebnými místy. Jedná se o slibné techniky v klinické diagnostice a terapii. Tyto nové poznatky o genetice nádorů podnítily převratné poznatky o vývoji nových léků, které mohou dané nádory léčit, zmenšovat a přimět k dlouhodobé remisi

.

Napsat komentář