Biosintesi dell’acido ribonucleico (RNA) nel cancro umano

Rudolf Virchow (1821-1902) è generalmente accreditato come il primo a riconoscere le cellule leucemiche, e Fridrich Miescher (1844-1895) aveva identificato e isolato la sostanza cellulare contenente azoto e fosforo, mentre Albrecht Kossel (1853-1927) isolò gli acidi nucleici: due purine (adenina e guanina) e tre pirimidine (timina, citosina e uracile). Il cancro è comunque definito come un gruppo di più di 100 malattie diverse che è causato da molteplici cambiamenti nel DNA e RNA cellulare, ed è caratterizzato da una crescita incontrollabile (mitosi) in cui le cellule sono aggressive, invasive e talvolta metastatiche. Inoltre, la scoperta della doppia elica della molecola di DNA da parte di Watson e Crick è stata un’ulteriore pietra miliare nella scienza del ventesimo secolo (Figura 1). Il materiale genetico degli organismi viventi e la doppia elica della molecola di DNA hanno costituito il fondamento della nuova disciplina della biologia molecolare.

Figura 1

Gli acidi nucleici essenziali RNA a singolo filamento e DNA a due filamenti.

Un giro completo della doppia elica del DNA si estende su dieci coppie di basi che coprono una distanza di 34 Ǻ (3,4 nm). Le singole coppie di basi sono distanziate di 34 Ǻ (3,4 nm). I punti in cui i filamenti si incrociano nascondono coppie di basi che si estendono perpendicolarmente all’osservatore. Il diametro interno è 11 Ǻ (1,1 nm), e il diametro esterno 20 Ǻ (2,0 nm). All’interno del profilo cilindrico della doppia elica ci sono due scanalature che sono abbastanza grandi da ospitare catene polipeptidiche. Il più grande cromosoma umano, il cromosoma numero 1, consiste di circa 220 milioni di coppie di basi ed è lungo 85 nm. I segni meno accanto ai filamenti della doppia elica rappresentano molti gruppi fosfato caricati negativamente lungo l’intera lunghezza di ogni filamento. A differenza del DNA a doppio filamento, l’RNA è una molecola a filamento singolo in molti dei suoi ruoli biologici e ha una catena di nucleotidi molto più corta. Tuttavia, l’RNA può, tramite l’accoppiamento complementare delle basi, formare doppie eliche intra-filo, come nel tRNA. Mentre il DNA contiene deossiribosio, l’RNA contiene ribosio (nel deossiribosio non c’è nessun gruppo idrossile attaccato all’anello pentoso nella posizione 2′). Questi gruppi idrossilici rendono l’RNA meno stabile del DNA perché è più incline all’idrolisi. La base complementare all’adenina non è la timina, come nel DNA, ma l’uracile, che è una forma non metilata della timina.

Adottato da: Watson J.D. e Crick, F.H.C. (1953) “Molecular structure of nucleic acid. A structure of deoxyribosenucleic acid”, Nature, vol.171, pp.737-738; Gregory, S., Barlow, K.F., McLay, K.E., Kaul, R., Swarbreck, D., Dunham, A., Scott, C.E., Howe, K.L. and Woodfine, K. (2006). “La sequenza del DNA e l’annotazione biologica del cromosoma umano 1”. Nature, vol. 441 (7091), pp.315-221; Nelson, D.L. and Cox, M.M. (2008) Lehninger Principles of Biochemistry, 5th edn, pp.277-287. New York, NY: W.H. Freeman and Company.

Il meccanismo dettagliato con cui tale materiale genetico poteva essere espresso come le proteine strutturali e catalitiche che svolgono un ruolo così importante nel funzionamento di tutte le cellule viventi non era ancora ovvio. Stanley Miller (1930-2007) e Harold Urey (1893-1981) progettarono un esperimento che simulava condizioni ipotetiche che si pensava fossero presenti al tempo della prima vita sulla terra e testarono qualitativamente la presenza di elementi chimici terrestri che hanno dato origine alla vita. Gli elementi chimici essenziali di H2, CH4, H2O e NH3 che erano confinati in fiasche e tubi di vetro sterili, furono sottoposti a scariche elettriche e l’interazione produsse 20 aminoacidi, il blocco di costruzione delle proteine, così come altri composti organici come: adenosina trifosfato, lipidi, alcuni zuccheri e le basi per RNA e DNA (Lazcano e Bada).

Crick et al. progettarono un’elegante strategia sperimentale per determinare la natura del codice genetico che fu notevolmente corretta nonostante l’assenza di tecnologia per analizzare e confrontare la sequenza di DNA e proteine. Il codice genetico è la relazione tra la sequenza di basi nel DNA (o nei suoi trascritti RNA) e la sequenza di amminoacidi nelle proteine. Le caratteristiche del codice genetico sono le seguenti: (1) tre nucleotidi codificano un amminoacido, (2) il codice non è sovrapposto, (3) il codice non ha punteggiatura, e (4) il codice genetico è degenerato.

La prolina differisce da questa struttura di base solo perché contiene un anello insolito al gruppo amminico dell’estremità N, che forza la parte amidica CO-NH in una conformazione fissa. Una volta fatta questa scoperta concettuale, il complesso compito di svelare le molte fasi della biosintesi proteica potrebbe iniziare in laboratorio. La sequenza di amminoacidi in una proteina è definita da un gene e codificata nel codice genetico. Anche se questo codice genetico specifica 20 diversi L-α-amminoacidi, i residui in una proteina sono spesso alterati chimicamente nella modifica post-traslazionale: o prima che la proteina possa funzionare nella cellula, o come parte dei meccanismi di controllo.

I geni sono fatti di acidi nucleici che contengono le istruzioni per fare le proteine; anche gli enzimi sono fatti di proteine e sono necessari per replicare i geni .

L’informazione genetica codificata nei due filamenti complementari del DNA di ogni gene strutturale è trascritta da un enzima chiamato DNA polimerasi RNA dipendente che catalizza la sintesi di RNA da un modello di DNA o RNA . Le RNA polimerasi eucariotiche (pol-I, pol-II e pol-III sono le macchine multiproteiche centrali. La RNA polimerasi DNA-dipendente fa una copia di RNA a singolo filamento, complementare a uno dei filamenti che sono chiamati mRNA. Questo si attacca a un ribosoma dell’organello subcellulare che è composto da due subunità tra 25 e 30 nm (250-300 Å) di diametro con un rapporto rRNA/rotaina che è vicino a 1. Funziona come una scatola nera sulla quale viene tradotto l’mRNA. Il termine traduzione comprende tutti i passaggi attraverso i quali il contenuto genetico dell’mRNA contenuto nella sequenza lineare di ribonucleotidi viene convertito in una sequenza lineare di amminoacidi. Mentre l’mRNA potrebbe essere considerato il mezzo con cui l’informazione genetica viene effettivamente trasmessa dal genoma (il DNA), e collocato nei siti citoplasmatici appropriati per la traduzione in proteine. La biogenesi e la manutenzione degli organelli richiede proteine appena sintetizzate, ognuna delle quali ha bisogno di passare dal ribosoma che traduce il suo mRNA alla corretta traslocazione in un sottocomparto dell’organello. È interessante notare che è stato dimostrato che il gene associato al grasso e all’obesità si trova sul cromosoma 16 della demetilasi dell’mRNA, cioè la metilazione dell’mRNA gioca un ruolo critico nell’omeostasi energetica umana .

Gli acidi nucleici sono assemblati da singoli nucleotidi proprio come le proteine sono assemblate da singoli aminoacidi. I nucleotidi sono sintetizzati da una serie di reazioni mediate da enzimi. Le vie biochimiche sono perseguite separatamente per la sintesi del ribosio e delle diverse basi che sono poi assemblate per formare i trifosfati nucleotidici. La molecola portatrice di energia ATP, che consiste nella base adenina, ribosio e tre gruppi fosfato, è anche uno dei nucleotidi utilizzati nella sintesi dell’RNA, e gli altri sono guanosina trifosfato, citidina trifosfato e uridina trifosfato. Questi nucleotidi sono solitamente sintetizzati dal trasferimento di energia da ATP alle loro forme di difosfato dei nucleotidi. Così, c’è un pool generale di trifosfati nucleotidici che funzionano come mattoni per l’RNA all’interno della cellula. Questi nucleotidi liberi assemblati in una sequenza lineare in cui la molecola di RNA contiene alcune delle informazioni codificate che sono presenti nel DNA, e quando il DNA viene copiato in mRNA utilizzando l’accoppiamento di base di adenina-timina, e guanina-citosina è il processo di trascrizione del DNA. Durante la sintesi dell’mRNA, i legami tra queste coppie nel DNA, adenina-timina e guanina-citosina, e la struttura a doppio filamento si srotola parzialmente e i due filamenti si separano. Le basi dei trifosfati nucleotidici liberi e le basi in una delle catene di DNA separate formano nuovi legami. Il DNA funge quindi da modello per comandare la sequenza delle basi nell’RNA. La base adenina nel nucleotide libero si accoppierebbe con la base timina nel DNA, e la base uracile nel nucleotide libero si accoppierebbe anche con la base adenina nel DNA. Allo stesso modo, la base citosina nel nucleotide libero si accoppia con la base guanina nel DNA, e la base guanina nel nucleotide libero si accoppia con la base citosina nel DNA. Il risultato risultante sarebbe una nuova sequenza di basi nell’RNA che è un’immagine speculare enantiomerica della sequenza di basi nel DNA. Poiché il vantaggio principale dell’accoppiamento delle basi nucleotidiche è che i due filamenti di DNA possono replicarsi facilmente e accuratamente, ogni base può accoppiarsi solo con un’altra base (timina con adenina, adenina con timina, citosina con guanina e guanina con citosina). Così, se il codone originale del DNA contiene la sequenza di base citosina-guanina-timina, la sequenza complementare del codone nell’mRNA è guanina-citosina-adenina.

Una volta che gli appropriati trifosfati nucleotidici liberi sono accoppiati alle basi corrispondenti nel DNA, i nucleotidi sono uniti l’uno all’altro dall’enzima RNA-polimerasi II (12 subunità) che provoca la scissione del pirofosfato dal trifosfato nucleotidico nel processo di collegamento di un nucleotide al successivo, formando la spina dorsale di zucchero-fosfato del mRNA. Questo enzima è attivo solo in presenza di DNA e non collega i trifosfati nucleotidici liberi insieme in sua assenza. L’enzima si muove lungo il filamento di DNA, collegando un nucleotide alla volta nella catena di mRNA in crescita. L’attività della RNA-polimerasi II è DNA-dipendente, il che significa che deve avere una molecola modello di DNA prima di poter sintetizzare la trascrizione di RNA. La polimerasi DNA-dipendente deve anche avere Mg2+ e ribonucleosidi 5′ trifosfati per poter effettuare la sintesi dell’RNA. La RNA polimerasi crea il nuovo filamento di RNA da 5′ a 3′.

L’espressione della proteina è determinata dal tasso di trascrizione e dai processi post-trascrizionali che portano a cambiamenti nel trasporto dell’mRNA, nella stabilità e nell’efficienza della traduzione. Questi processi post-trascrizionali sono mediati dalle modifiche dell’RNA, dalla struttura secondaria, dai micro RNA (miRNA) e dalle proteine leganti l’RNA che riconoscono gli elementi regolatori situati nelle regioni non tradotte 3′ dei trascritti. Il processo cellulare critico di poliadenilazione che è l’aggiunta della coda poli (A) all’mRNA che gioca ruoli importanti in molti aspetti del metabolismo cellulare dell’mRNA, anche se inizia come la trascrizione di un gene finisce o termina. Il segmento 3′-most del pre-MRNA appena fatto è prima scisso da una serie di proteine; queste proteine poi sintetizzano la coda poli (A) in uno qualsiasi dei diversi siti possibili. La scissione genera il gruppo 3′-idrossile libero che definisce la fine dell’mRNA a cui vengono immediatamente aggiunti residui di adenina dalla poliadenilato polimerasi che catalizza la reazione:

$$ \mathrm{R}\mathrm{N}\mathrm{A} + \mathrm{nATP} \circ ledR\ \mathrm{R}{mathrm{N}{mathrm{A}{hbox{-} {\left(\mathrm{A}\mathrm{M}\mathrm{P}\right)}_{\mathrm{n}} + {\mathrm{n}\mathrm{P}\mathrm{P}}_{\mathrm{i}} $$

dove n = 200-250 . La coda poly (A) e le sue proteine associate hanno maggiori probabilità di proteggere l’mRNA dalla distruzione enzimatica. I geni che codificano le proteine possono avere più di un sito di poliadenilazione, “extra RNA”, quindi un gene può codificare diversi mRNA che differiscono nella loro 3′-end, anche se la poliadenilazione mRNA è controllata da vari elementi cis-acting che circondano il sito di scissione e loro fattori di legame. Poiché la poliadenilazione alternativa cambia la lunghezza della regione non tradotta 3′, l’accorciamento globale delle regioni non tradotte 3′ attraverso la poliadenilazione alternativa è un segno distintivo emergente del cancro; può anche cambiare quali siti di legame per i miRNA la regione non tradotta 3′ contiene. Quindi, la poliadenilazione è un modo di marcare l’RNA per la degradazione per molti RNA non codificanti, tra cui tRNA, rRNA, snRNA e snoRNA. L’esosoma di RNA (30-100 nm) è un macchinario di degradazione conservato, che ottiene la piena attività solo quando è associato a cofattori; le code poly (A) sono state trovate su frammenti di RNA umano sia omopolimeriche che per lo più eterpolimeriche. La poliadenilazione regolata di specifici mRNA è coinvolta nell’oogenesi, nella progressione del ciclo cellulare e nella plasticità sinaptica. Molti fattori di transazione di poliadenilazione, tra cui la polimerasi di poliadenilazione, si trovano sempre più spesso coinvolti nel ciclo cellulare, nell’apoptosi e nella prognosi del cancro. Quindi, i geni che subiscono la scissione alternativa e la poliadenilazione durante la progressione del cancro umano possono essere utili biomarcatori nuovi e potenzialmente mirati per la prevenzione e il trattamento della malattia.

I micro RNA sono una classe endogena di regolatori post-trascrizionali che regolano ben un terzo dei geni umani; sono di piccola lunghezza (frammenti lunghi 21-25 nucleotidi) e a singolo filamento. Gli studi suggeriscono che circa la metà dei microRNA conosciuti risiedono in RNA non codificanti le proteine (introne ed extrone) o nell’introne di geni codificanti le proteine. Essi possono riconoscere e legarsi a sequenze complementari imperfette di base-accoppiamento nella regione 3′ non tradotta di più mRNA bersaglio, bloccando la traduzione dell’espressione genica o inducendo la scissione dell’mRNA per controllare una moltitudine di processi critici attraverso la riduzione o l’inibizione dell’efficienza traslazionale dell’mRNA bersaglio. Studi recenti hanno dimostrato che i miRNA sono espressi in modo aberrante in varie malattie umane, dal cancro all’ipertrofia cardiovascolare. I micro RNA hanno come bersaglio ~60% di tutti i geni, e sono abbondantemente presenti per reprimere 100 s di obiettivi in tutte le cellule umane; la bioinformatica indica che un RNA a singolo filamento di 22 nucleotidi composto da 4 diversi ribonucleotidi, può avere oltre 1013 possibili combinazioni di sequenza. Quindi, poiché la cellula contiene tipicamente ~1049 miRNA, ci deve essere una pressione di selezione evolutiva e di sviluppo molto alta che utilizza solo specifiche sequenze oligonucleotidiche di miRNA per produrre interazioni miRNA-mRNA biologicamente utili. La biogenesi dei miRNA è simile a quella di altri RNA a partire dalla trascrizione del DNA. Un miRNA primario è un trascritto indipendente processato dalla RNA polimerasi II e sono legati nel nucleo dal complesso “microprocessore” che consiste nella ribonucleasi III (un’endonucleasi Mg2+-dipendente), Drosha, e il suo co-fattore, Pasha (DGCR8). La generazione di miRNA maturi da miRNA precursori da parte della ribonucleasi III (complesso Dicer1 /TRBP nel citoplasma. Dicer è una ribonucleasi specializzata che avvia l’interferenza dell’RNA scindendo l’RNA a doppio filamento in frammenti di miRNA, e TRBP (la proteina legante l’RNA a doppio filamento del virus dell’immunodeficienza umana) è un componente integrale di un complesso contenente Dicer.

La neoplasia che comprende molte malattie è un’anomalia della differenziazione cellulare, della maturazione e del controllo della crescita. Rupert Allan Willis (1898-1980) definì la neoplasia come “una massa anormale di tessuto, la cui crescita supera ed è scoordinata con quella dei tessuti normali circostanti e persiste nella stessa maniera eccessiva dopo la cessazione degli stimoli che hanno evocato il cambiamento”, e questa definizione è quella ampiamente citata. Inoltre, diverse malattie neoplastiche e non neoplastiche hanno dimostrato di contenere acidi nucleici circolanti e che nel cancro hanno origine principalmente dal tumore. Quindi, il livello di acidi nucleici circolanti che sono stati associati con il carico tumorale e la progressione maligna, sono utilizzati per lo screening del cancro, la prognosi e il monitoraggio dell’efficacia di una terapia antitumorale.

Inoltre, Conrad H. Waddington (1905-1975) ha riportato un’intricata interazione tra l’ambiente cellulare e gli effetti dei geni sulla determinazione del fenotipo; ha attribuito i segnali molecolari al fenomeno epigenetico. I segnali epigenetici che sono responsabili dell’instaurazione, del mantenimento e dell’inversione degli stati trascrizionali metastabili, hanno una correlazione diretta con l’ipermetilazione del promotore e i geni soppressori del tumore silenziati, i fattori di trascrizione a monte e gli enzimi di riparazione del DNA. Dal momento che il cancro è in definitiva una malattia dei geni, il meccanismo con cui le informazioni epigenetiche vengono trasmesse attraverso la divisione cellulare rimangono poco chiare in quanto i complessi stati epigenetici sono orchestrati da diversi segnali convergenti.

Gli RNA biologicamente attivi, tra cui mRNA, tRNA, rRNA, piccoli RNA nucleici e altri RNA non codificanti, contengono sequenze autocomplementari che permettono a parti dell’RNA di piegarsi e accoppiarsi con se stesso per formare doppie eliche (Figura 2).

Figura 2

Il processo fondamentale del trasferimento di informazioni nelle cellule.

L’analisi di questi RNA ha rivelato che sono altamente strutturati e non consistono di lunghe doppie eliche ma piuttosto di collezioni di brevi eliche impacchettate insieme in strutture simili alle proteine. Gli RNA si piegano e si conformano alla catalisi chimica degli enzimi, per esempio, il sito attivo del ribosoma che analizza la formazione e il rilascio del legame peptidico è costituito interamente da RNA. L’rRNA è necessario come componente strutturale dei ribosomi su cui avviene effettivamente la traduzione e il tRNA è richiesto nell’attivazione degli aminoacidi, come adattatore nella specificazione degli aminoacidi diretta dall’mRNA e nel legare le catene proteiche in crescita ai ribosomi (Figura 2). Nel processo di trascrizione del DNA, il posizionamento delle unità nucleotidiche nelle molecole di RNA prodotte è sotto il controllo del DNA che funge da modello. Il modo in cui questo modello detta tale sequenza coinvolge sia le interazioni di accoppiamento delle basi che le interazioni specifiche tra proteine e acidi nucleici. Ogni catena di RNA è iniziata in un sito specifico sul modello di DNA e soggetta a terminare in un altro tipo unico di sito sul modello, cioè ci sono unità definite di trascrizione. Si tratta di un processo selettivo. Segnali specifici nel modello di DNA sono riconosciuti dall’apparato di trascrizione. L’iniziazione è governata da regioni promotrici nel DNA, e la regione che governa la terminazione è designata un terminatore .

(1) Trascrizione: L’informazione codificata nella sequenza nucleotidica del DNA viene trascritta attraverso la sintesi di mRNA la cui sequenza è dettata dalla sequenza del DNA. (2) Traduzione: Quando la sequenza di mRNA viene decodificata dal macchinario di sintesi proteica, viene tradotta nella sequenza di amminoacidi di una proteina. Questo trasferimento di informazioni è racchiuso nel dogma: DNA → RNA → Proteina.

Adottato da: Hernández, G. (2012) On the Emergence and Evolution of the Eukaryotic Translation Apparatus, in Cell-Free Protein Synthesis, Biyani, M. (ed.), p.32. Retrieved September13, 2014 from http://cdn.intechopen.com/pdfs-wm/39965.pdf.

Archibald Garrod (1857-1936) fu uno dei primi scienziati a proporre che i fattori ereditari (geni) controllavano la funzione delle proteine. I difetti (malattie) nel metabolismo potrebbero essere legati al fallimento di enzimi specifici per catalizzare reazioni biochimiche essenziali. La sintesi delle proteine, la traduzione, è diretta da una molecola di mRNA. La traduzione può avvenire in due fasi: (1) trasferimento di informazioni, in cui la sequenza di basi dell’RNA dell’mRNA determina la sequenza degli amminoacidi e (2) processi chimici, in cui si formano i legami peptidici tra gli amminoacidi adiacenti. I componenti necessari per la traduzione includono: mRNA, ribosomi (60S e 40S), tRNA, aminoacil tRNA sintetasi, e proteine accessorie coinvolte nell’iniziazione, nell’allungamento e nella terminazione. L’allungamento può essere pensato per coinvolgere tre processi: (1) allineare ogni tRNA aminoacilato, (2) formare il legame peptidico per aggiungere il nuovo amminoacido alla catena polipeptidica, e (3) spostare il ribosoma lungo l’mRNA di altre tre basi (un codone). L’allungamento procede fino al raggiungimento di un codone di stop. Ci sono tre codoni di stop nel codice genetico: UAG, UGA, UAA.

È eccezionalmente difficile valutare gli effetti cancerogeni di così tanti prodotti chimici agricoli, industriali e domestici, ma un pericolo significativo è rappresentato dallo smaltimento di vari rifiuti agricoli e industriali che possono contaminare l’acqua potabile, le acque costiere e l’inquinamento della vita marina. Inoltre, l’identificazione di un cancerogeno chimico è problematica a causa del lungo ritardo tra l’esposizione chimica e lo sviluppo del cancro, a meno che l’effetto sia drammatico. In considerazione del vasto numero di sostanze chimiche che le persone hanno incontrato durante la loro vita, la tabella 1 mostra le sostanze chimiche cancerogene più fortemente evidenziate.

Tabella 1 Principali agenti chimici cancerogeni nell’uomo

Il virus è un virione ultramicroscopico avvolto in un rivestimento protettivo di proteine, agente infettivo, parassiti intracellulari obbligatori la cui replicazione dipende dal suo nucleo DNA o RNA e dal processo di sintesi proteica della cellula ospite per la crescita nella cultura dei tessuti. I principali patogeni dei virus sono adenoviridae, flaviviridae, hepadnaviridae, herpesviridae, homyxoviridae, papovaviridae, paramyxoviridae, picornaviridae, polyomaviridae, orthomyxoviridade, rhabdoviridae e togaviridae . L’infezione virale raggiunge comunemente il tempo ottimale in funzione della replicazione quando appaiono i sintomi clinici, e la replicazione consiste nelle seguenti fasi: (1) attaccamento e penetrazione della cellula suscettibile, (2) smontaggio delle proteine non strutturali per rendere disponibile l’acido nucleico per la moltiplicazione del virus, (3) sintesi di RNA o DNA attraverso la trascrizione e la traduzione (Figura 2), (4) sintesi di proteine strutturali e funzionali, e (5) assemblaggio e rilascio di particelle virali mature dalla cellula . La tabella 2 mostra gli agenti chimici antivirali che bloccherebbero clinicamente la replicazione del virus quando vengono somministrati all’insorgere della malattia, cioè la chemioprofilassi.

Tabella 2 Agenti antivirali e alcune delle loro proprietà

Metodologia

Al momento dell’infezione, un RNA virale permea le membrane delle cellule ospiti umane, dopodiché viene distrutto da diverse RNasi cellulari, oppure si lega ai ribosomi e cresce e si divide per produrre proteine ad un ritmo sregolato. Il processo del ciclo di trascrizione che consiste in: preiniziazione, iniziazione, cancellazione del promotore, allungamento e terminazione ha un impatto significativo sul potenziale di crescita dei tumori. L’incapacità della cellula ospite di riconoscere e distruggere l’infezione virale è causata dalla mancanza di particolari molecole co-stimolate che aiutano il modo in cui gli antigeni reagiscono con i linfociti. Quindi, la ricerca di base sul cancro comporta l’identificazione delle cause e lo sviluppo di strategie di prevenzione, diagnosi, trattamenti e cura. La ricerca abbraccia la chemioterapia, la terapia ormonale, la terapia immunitaria, i nanomateriali, la chirurgia palliativa, la radioterapia e le modalità di trattamento combinato; e i metodi di valutazione sono stati principalmente: (1) metodi citologici (citologia esfoliativa e aspirativa), (2) citometria a flusso, (3) metodi istologici, (4) immunoistochimica, (5) diagnosi molecolare (aptamers), (6) marcatori tumorali (ormoni (calcitonina, metaboliti della catecolamina &, ectopici, gonadotropina umana cronica-HCG), antigeni oncofetali (proteina α-fetale, antigene embrionale carcino), isoenzimi, proteine specifiche, mucine e glicoproteine, nuovi marcatori molecolari).

RNA fago di ogni fase della sintesi proteica che potrebbe essere possibile controllare, è indicativo della biosintesi individuale interrelata di una data proteina . Il tasso di formazione del complesso di iniziazione detta la quantità di ciascuna delle proteine virali. Le RNA polimerasi iniziano a replicare l’RNA virale, un processo dei mediatori più centrali della trasformazione maligna. L’RNA polimerasi I, l’RNA polimerasi II e l’RNA polimerasi III trascrivono i geni codificanti le proteine e interagiscono con i fattori coinvolti nella sintesi del precursore rRNA 45S, nel rimodellamento della cromatina, nell’attivazione trascrizionale, nell’elongazione e nell’elaborazione dell’RNA.

Gli enzimi umani eucariotici multicellulari possono essere purificati usando organelli isolati, come nucleo, nucleoli, mitocondri e altri organelli interni come materiale di partenza, anche se il recupero simultaneo di tutte e tre le RNA polimerasi non è sempre fattibile a causa della natura diffusibile di alcuni enzimi nucleari. Jacob e Rose avevano ampiamente rivisto i metodi di solubilizzazione, purificazione e difficoltà delle RNA polimerasi dei mammiferi.

Le cellule HeLa erano spesso la fonte dei complessi di RNA polimerasi; le cellule mitotiche e i tessuti tumorali con i corrispondenti tessuti normali che possono essere raccolti e congelati in azoto liquido a -80°C, sono conservati in modo vitale fino al saggio. L’esame istopatologico viene effettuato sui campioni di tessuto fissati in formalina al 10% e fissati in paraffina, una risorsa preziosa per la ricerca clinica, anche se gli acidi nucleici estratti sono frammentati e chimicamente modificati, il che li rende difficili da utilizzare negli studi molecolari. Le osservazioni istopatologiche sono utilizzate nella progressione, nella suscettibilità metastatica, nella sensibilità terapeutica e radioterapica e nella prognosi. È interessante notare che la tecnica non invasiva della spettroscopia Raman permette l’osservazione delle molecole biologiche intracellulari senza procedure di fissazione o etichettatura in situ .

Il test di quantificazione delle proteine del kit dell’acido bicinchoninico che è ampiamente utilizzato per determinare le concentrazioni di proteine nella regione 25-2000 μg/ml. Le cellule sono sospese e lisate in tampone ipotonico (20 mM Tris-HCl , 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM ZnCl2 contenente 1% Triton X-100) per 5 min in ghiaccio; sono state poi separate in frazioni nucleolari e nucleoplasmatiche mediante centrifugazione zonale in saccarosio a 15.000 rpm per 15 min a 4°C, e il surnatante è stato raccolto e congelato a -20°C fino a nuovo utilizzo. Questo metodo è una forma modificata dei metodi Lowry et al. e Bradford che sono anche ampiamente utilizzati dye-binding variazioni proteiche saggi cromogeni. Il test della proteina Bradford si basa sull’associazione di specifici residui di aminoacidi, arginina, lisina e istidina, con gruppi non coniugati di colorante Coomassie blu brillante G-250, in un ambiente acido. Quando si forma il complesso colorante-proteina, il pKa della soluzione acida rosso-marrone si converte in blu e si misura a 595 nm. Il colorante Bradford è un protocollo comodo da usare, veloce e relativamente sensibile, ma diversi composti possono interferire con il test contro le curve standard tipiche per l’albumina di siero bovino e la gamma globulina bovina. L’altro Lowry et al. saggio proteico risiede nella formazione del complesso peptide azoto (s) con Cu2+ in condizioni alcaline (pH 10.0-10.5), e la successiva riduzione del reagente dell’acido fosfomolibdico Folin-Ciocalteay a eteropolimolibdeno blu a spettri 750 nm, anche se l’acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) può interferire con la produzione di cromoforo .

La radioimmunoistochimica è una tecnica molto sensibile in vitro in cui un isotopo radioattivo tracciabile etichetta un marcatore per rilevare, identificare e quantificare la concentrazione di una o più sostanze neoplastiche specifiche. Il radioimmunodosaggio è stato sviluppato per identificare e quantificare la concentrazione di RNA polimerasi I, RNA polimerasi II, RNA polimerasi III e mRNA. Anche se è meno sensibile dell’attività enzimatica come misura della trascrittasi inversa, ma può rilevare l’antigene utilizzando quantità minime di proteine e in presenza di inibitori per un virus tumorale RNA che produce cellule .

Le tre RNA polimerasi trascrivono il genoma nei nuclei delle cellule. La RNA polimerasi II, responsabile della sintesi dell’mRNA e di una grande varietà di RNA non codificanti, è la più importante; la produzione di RNA nelle cellule in crescita è effettuata dalla RNA polimerasi I che trascrive il precursore del grande rRNA, e dalla RNA polimerasi III che trascrive rRNA, tRNA, e alcuni RNA non codificanti. Hossenlopp et al. hanno usato il siero anti-polimerasi I per classificare le tre RNA polimerasi in ordine di inibizione: I > III > I, indicando che le polimerasi I e II sono più strettamente correlate delle polimerasi I e II.

Risultati e interpretazioni

L’effetto differenziale dell’inibizione selettiva sulla sintesi di RNA nucleare e nucleoplasmatica è legato all’esistenza di RNA polimerasi nucleari e cromosomiche distinte che causano risposte biochimiche e morfologiche simili alla mitosi. Inoltre, la sintesi dei ribosomi nelle cellule HeLa ha dimostrato di essere controllata a livello di elaborazione piuttosto che a livello di trascrizione dell’RNA 45S dove gli agenti chimici causerebbero le transizioni fisiologiche e strutturali della mitosi virale. La tabella 2 elenca alcuni di questi agenti terapeutici che possono essere considerati per interferire con il processo di replicazione del virus.

In conclusione, l’avvento del sequenziamento del genoma umano ha facilitato gli impressionanti progressi nella diagnosi, prognosi e metodologie di trattamento delle cellule tumorali umane invasive. Una nuova area di ricerca sugli agenti chimici che interferiscono con la morte cellulare legata alla mitosi (apoptosi), sono in grado di denaturare le cellule neoplastiche resistenti alla chemioterapia e inibire l’espressione delle proteine. Giri e Kumar hanno riportato che la sovraespressione della neo-polimerasi (A) nelle cellule tumorali umane indica l’importanza della poliadenilazione negli eventi cellulari del cancro. La specificità di un’interazione elettrostatica tra l’RNA e gli alcaloidi naturali o i loro analoghi sintetici è stata trovata per essere in grado di indurre l’auto-struttura nella poliadenelizzazione. Quindi, nuovi composti nuovi che mostrano un’eccellente affinità di legame a molte strutture di RNA, possono essere utilizzati per modulare la struttura del poli (A) nello sviluppo di terapie antitumorali mirate all’RNA. Le nanoparticelle di aptamers stanno anche emergendo per mirare alla reazione di epitopi specifici dell’antigene con i loro siti di legame. Queste sono tecniche promettenti nella diagnosi e nella terapia clinica. Queste nuove intuizioni sulla genetica dei tumori hanno indotto intuizioni rivoluzionarie nello sviluppo di nuovi farmaci che possono trattare, ridurre e convincere determinati tumori a una remissione prolungata.

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